[發明專利]一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法

無效

• 申請號: 201410094849.X
• 申請日: 2014-03-16
• 公開（公告）號: CN103820524A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 陳歡;楊進;劉洋;劉彤;韓書磊;吳帥賓;付立偉;侯宏衛;胡清源
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明涉及卷煙煙氣體外毒理學評價研究領域，具體說是一種基于乳酸脫氫酶（LDH）測定卷煙煙氣粒相物或氣相物細胞毒性的方法。

背景技術

開展體外毒理學實驗是評價吸煙對健康危害的重要方法。其中，細胞毒性在包括癌癥、炎癥等許多病理過程中起到重要作用，細胞毒性試驗是了解化合物與細胞和組織之間作用機理的重要途徑。如何科學準確地評價卷煙產品以及煙草添加劑的危害性，目前國際上還沒有統一的方法和程序。檢測細胞毒性可通過多種生物學終點進行，例如通過測定酸性磷酸酶或其他蛋白活性來計算細胞數量、測定細胞代謝活性以及檢測細胞膜的完整性等生物學終點進行評價。根據不同檢測原理開展細胞毒性評價，可從不同角度揭示卷煙煙氣細胞毒性的作用機理。

細胞凋亡或化合物染毒而造成的細胞膜結構的破壞會導致細胞漿內的酶釋放到培養液里，其中包括酶活性較為穩定的乳酸脫氫酶(lactate?dehydrogenase,?LDH)。通過檢測釋放的乳酸脫氫酶的活性，可表征細胞膜的完整性，實現對化合物細胞毒性的定量分析。

目前，進行卷煙煙氣細胞毒性評價時采用的方法大多基于細胞存活率測定的原理，考察卷煙煙氣染毒對細胞膜完整性的影響還研究較少，亟需建立基于LDH測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，定量準確評價卷煙煙氣粒相物和氣相物的細胞毒性。

發明內容

本發明的目的是建立的一種基于LDH測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，為卷煙產品的細胞毒性評價提供方法學支持。LDH法的測定原理是基于在乳酸脫氫酶的作用下，氧化型輔酶Ⅰ（NAD+）被反應生成的還原型輔酶Ⅰ（NADH），再與氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（INT）在硫辛酰胺脫氫酶（diaphorase）的催化下反應生成強生色物甲臜（formazan），在490nm波長下產生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細胞膜完整性的標志，實現對細胞毒性的定量分析。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，包括以下步驟：

1）配制實驗試劑：有以下幾種：

1、LDH基質液的配制：用0.2?mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液（pH8.2）配制LDH基質液，其中各成分及其終濃度分別為：乳酸鋰5×10-^2?mol/L、硝基氯化四氮唑（INT）?6.6×10^-4?mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）?2.8×10^-4?mol/L、氧化型輔酶Ⅰ（NAD）?1.3×10^-3?mol/L，LDH基質液應在臨用前配制。

2.?細胞裂解液：?20%的曲拉通100（Triton-100）。

3．終止液：4M的鹽酸（HCl）溶液。

4.細胞培養基：溶劑為RPMI-1640?培養基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2?mM，青霉素的濃度為100?IU/ml，鏈霉素的濃度為100μg/ml。

5.卷煙煙氣染毒溶液：煙氣染毒溶液包括煙氣粒相物萃取液和煙氣氣相物吸收液。其具體制備方法如下：卷煙樣品于溫度（22±1）℃和相對濕度60%±3%條件下平衡48?h；然后使用轉盤式吸煙機抽吸卷煙，煙氣總粒相物用劍橋濾片收集，根據煙氣總粒相物質量加入相應體積的DMSO溶劑，得到最終濃度為10?mg/ml的煙氣粒相物萃取液，使用前在－70?℃以下儲存；在收集煙氣總粒相物的同時將氣相物通入裝有PBS溶液的吸收瓶（冰浴）中，粒相物收集完畢后，將PBS吸收液定容至與煙氣粒相物萃取液中DMSO體積相同，通過0.2?μm的濾膜除菌后，得到最終濃度與煙氣粒相物萃取液相當的煙氣氣相物吸收液，且必須在制備后半小時內使用。

2）細胞接種：本方法所用細胞系為中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞。由于不同的細胞系中LDH酶的含量不同，因此在考察卷煙煙氣對CHO細胞系的細胞毒性時，需開展預實驗，對細胞接種密度進行優化。向96孔板的每孔中加入100?μL細胞懸液，按照優化好的細胞接種密度進行細胞接種，96?孔板的最外周36?個孔中每孔加入100?μl?生長培養液作為空白對照，其余每孔加入100?μl?細胞懸液，于37?℃、5%?CO2?條件下培養24?h。