[發(fā)明專利]一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410094849.X
• 申請日: 2014-03-16
• 公開（公告）號: CN103820524A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳歡;楊進;劉洋;劉彤;韓書磊;吳帥賓;付立偉;侯宏衛(wèi);胡清源
• 申請（專利權(quán)）人: 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）?配制實驗試劑：?

（1）LDH基質(zhì)液的配制：用0.2?mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液（pH8.2）配制LDH基質(zhì)液，其中各成分及其終濃度分別為：乳酸鋰5×10-^2?mol/L、硝基氯化四氮唑（INT）?6.6×10^-4?mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）?2.8×10^-4?mol/L、氧化型輔酶Ⅰ（NAD）1.3×10^-3?mol/L，LDH基質(zhì)液應(yīng)在臨用前配制；

（2）?細胞裂解液：?20%的曲拉通100（Triton-100）；

（3）終止液：4M的鹽酸（HCl）溶液；

（4）細胞培養(yǎng)基：溶劑為RPMI-1640?培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2?mM，青霉素的濃度為100?IU/ml，鏈霉素的濃度為100μg/ml；

（5）卷煙煙氣染毒溶液；

2）?細胞接種：所用細胞系為中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞；向96孔板的每孔中加入100?μL細胞懸液，按照優(yōu)化好的細胞接種密度進行細胞接種，96?孔板的最外周36?個孔中每孔加入100?μl?生長培養(yǎng)液作為空白對照，其余每孔加入100?μl?細胞懸液，于37?℃、5%?CO2?條件下培養(yǎng)24?h；

3）卷煙煙氣染毒：使用細胞培養(yǎng)基將卷煙煙氣染毒溶液調(diào)整到不同濃度，設(shè)置7個非零濃度，細胞接種24h后，吸去培養(yǎng)液，96?孔板（除最外周36?孔）每列6?孔為一組分別設(shè)置為正常對照組、7個不同劑量的煙氣染毒組和LDH最大釋放組，正常對照組和LDH最大釋放組均每孔加入100?μl的細胞培養(yǎng)基，煙氣染毒組每孔加入100?μl不同濃度的煙氣染毒溶液，96?孔板的最外周36?個孔中選擇其中6個孔作為培養(yǎng)基背景對照，再選擇6個孔加入最高染毒溶液作為染毒溶液背景對照，于37?℃、5%?CO₂?條件下培養(yǎng)24?h；

4）LDH測定：染毒結(jié)束前15分鐘，在LDH最大釋放量孔中加入5μl裂解液，染毒結(jié)束后使用250g離心力對細胞培養(yǎng)板離心5分鐘，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μlLDH基質(zhì)液，反應(yīng)一段時間后，加入50μl終止液，使用酶標儀檢測每孔在490?nm?波長處的吸光值；

5）結(jié)果與分析

原始吸光值A(chǔ)?：A?=?A490?nm?

A(染毒孔吸光度值)=6個平行孔的吸光度平均值

A(染毒溶液背景)=6個平行孔的吸光度平均值

A(培養(yǎng)基背景)=6個平行孔的吸光度平均值

A(空白對照組)=6個平行孔的吸光度平均值

A(最大釋放組)=6個平行孔的吸光度平均值

。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于：在開展細胞毒性評價前，需對染毒所用細胞株的細胞接種密度進行優(yōu)化，選擇LDH最大釋放量與空白對照組吸光度值相差最大，且細胞處于指數(shù)增長期的細胞個數(shù)作為最優(yōu)細胞接種密度，本發(fā)明中CHO細胞的最佳接種密度為10000個/孔。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于：細胞裂解液使用時其終濃度為1%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于：?LDH基質(zhì)液的反應(yīng)時間為15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于：煙氣染毒溶液包括煙氣粒相物萃取液和煙氣氣相物吸收液，煙氣粒相物萃取液、煙氣氣相物吸收液細胞毒性濃度的染毒區(qū)間分別包括50μg/ml-250?μg/ml和100μg/ml-400?μg/ml范圍。