[發明專利]一種尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的超高效液相色譜測定方法

無效

• 申請號: 201410093955.6
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103822989A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 楊進;石龍凱;胡清源;王安;劉勇;侯宏衛;劉彤;韓書磊;吳帥賓;陳歡
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術領域

本發明屬于尿液樣本的理化檢驗技術領域，具體來說是一種采用超高效液相色譜儀測定尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量的分析測定方法。

背景技術

苯乙烯是塑料橡膠工業的重要原料，它是無色油狀液體，有芳香氣味，用以制造各種塑料樹脂，合成橡膠。日常生活和工業生產中廣泛使用的含有苯乙烯的塑料橡膠制品，如各種包裝材料、隔熱材料、一次性飯盒、紙杯、管道、容器等。苯乙烯還存在于卷煙煙氣中，苯乙烯主要以氣體形式通過呼吸道，或通過皮膚接觸進入人體，對眼和上呼吸道粘膜有刺激和麻醉作用，短時間接觸高濃度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激癥狀；長時間接觸苯乙烯可引起肺組織結構損害，從而使人易患肺炎、肺氣腫等疾病。國際癌癥研究組織將其列為Group?2A，即對人類為很可能致癌物，對動物則為確定之致癌物。吸入體內的苯乙烯在CYP2B6和CYP2E酶的作用下代謝為苯乙烯7，8-氧化物，苯乙烯7，8-氧化物在環氧化物酶的作用下進一步代謝為苯乙醛酸和苯乙醇酸，苯乙醛酸和苯乙醇酸（兩者結構式如下），目前已經被用作苯乙烯暴露的生物標志物。

目前，分析尿液中苯乙烯的代謝物—苯乙醛酸和苯乙醇酸的方法主要有：液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質譜法和液相色譜串聯質譜法。由于尿液基質比較復雜，采用液相色譜的方法檢測往往需要經過復雜的前處理來凈化樣品，而且分析時間長，不適用于大規模檢測；氣相色譜質譜方法需要先對樣品進行衍生化處理；而液相色譜串聯質譜雖然靈敏度高、檢測限低，但價格昂貴，不利于普及，應用范圍窄。

發明內容

本發明的目的旨在克服現有技術缺陷，建立一種簡單、快速、選擇性好的測定尿液中的苯乙醛酸和苯乙醇酸的超高效液相色譜的方法，具體是采用超高效液相色譜儀測定尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量的方法，該方法能快速、準確檢測尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量，測定結果準確、測定干擾少，分離分析時間短。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量的測定方法，其特征在于：包括以下工藝步驟：

a、收集志愿者尿液。

b、樣品前處理：室溫下解凍尿液樣品，混合均勻后，經過0.22?μm的水相濾膜過濾，取1.0?mL的尿液，加入1.0?mL?6?mol/L的鹽酸和4.0?mL混合萃取溶液（二氯甲烷：異丙醇，9:1），2000?r/min振蕩提取3分鐘，10000?r/min離心1分鐘，取下層有機相1.0?mL，于40℃氮吹至干，加入0.2?mL流動相復溶，取5?μL引入超高效液相色譜儀分離分析。

c、標準工作液配制：用純水配制不同濃度的苯乙醛酸和苯乙醇酸混合標準工作溶液，濃度分別為0.085，0.17，0.425，0.85，4.25和8.5?μg/mL和0.25，0.5，1，2，10和20?μg/mL。

d、超高效液相色譜（UPLC）測定，吸取配制好的不同濃度的苯乙醛酸和苯乙醇酸混合標準工作溶液，注入超高效液相色譜系統，苯乙醛酸和苯乙醇酸的線性回歸方程分別為y?=?1.12×10⁵x+1.36×10⁴和y?=?1.94×10⁴x－2.48×10³，其中y代表目標分析物的峰面積，x表示尿液中目標分析物的濃度。相關系數均大于0.9990，對樣品待測液進行測定，得到分析物的色譜峰面積，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。

本發明中選取Waters?ACQUITY?UPLC^??BEH色譜柱（50?mm×2.1?mm，1.7?μm）；流動相體系為甲醇：0.01%混合酸水溶液（15:85）；等度洗脫；流動相流速150?μL/min；分析時間為8?min；進樣量為5?μL。

超高效液相色譜檢測器條件：光電二極管陣列檢測器，檢測波長：225?nm、254?nm；柱溫箱溫度：30℃。

本發明方法的線性范圍和檢出限：