[發明專利]一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母

有效

• 申請號: 201410093771.X
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103923847A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 陳堅;周景文;郭洪偉;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/50;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母，屬于代謝工程領域。?

背景技術

α-酮戊二酸作為三羧酸循環（TCA）途徑中重要中間產物之一，在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，不僅是三羧酸循環中的關鍵節點，在生物體內參與氨基酸、蛋白質、維生素的合成以及能量代謝；而且是微生物調控碳氮代謝平衡的重要節點，在研究與微生物氮代謝相關的調控機制方面具有重要作用。在工業上，α-酮戊二酸是重要的精細化工和醫藥工業的中間體，廣泛用于合成多種氨基酸、維生素和其它小分子物質，在醫藥、有機合成、營養強化劑等領域都有著重要的應用前景。?

由于α-酮戊二酸在微生物胞內代謝中的特殊地位，篩選得到的α-酮戊二酸生產菌株，在高產α-酮戊二酸的同時，在發酵終期仍然會積累大量丙酮酸等代謝副產物。中間代謝產物丙酮酸是細胞進行TCA循環的前體物質，丙酮酸進入TCA循環的代謝通量不僅與菌體細胞維持生長有關更決定終產物α-酮戊二酸積累量。并且，由于丙酮酸和α-酮戊二酸具有相似的物理化學性質，大量存在丙酮酸增加了下游分離純化過程的困難和成本。因此強化丙酮酸進入TCA循環不僅強化了細胞積累α-酮戊二酸所需的前體物質，也為下游分離純化過程降低了難度和成本。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母基因工程菌，通過過量表達丙酮酸脫氫酶E1組分α亞基的編碼基因pda1強化丙酮酸脫氫酶活力，促進丙酮酸脫氫形成乙酰-CoA，強化進入三羧酸循環的碳代謝流，為脂亞洛酵母（Yarrowia?lipolytica）WSH-Z06合成α-酮戊二酸增加前體供應。?

所述基因pda1的核苷酸序列為NCBI中GeneID:2908574所示的核苷酸序列。?

所述基因工程菌是以解脂亞洛酵母WSH-Z06CCTCCNO：M20714為宿主，以含有潮霉素轉磷酸移酶為篩選標記的整合型表達載體p0(hph)為表達載體。?

所述解脂亞洛酵母Yarrowia?lipolytica?WSH-Z06從中國典型培養物保藏中心CCTCC獲得，菌種保藏編號為CCTCCNO：M20714。過量表達基因pda1后，重組菌株細胞內乙酰-CoA含量提高，胞外丙酮酸含量下降，并且積累的α-酮戊二酸含量上升。?

一種構建所述解脂亞洛酵母基因工程菌的方法，包括以下步驟：（1）擴增潮霉素磷酸轉?移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，利用限制性內切酶StuI與Hind?III同時處理擴增得到的hph基因和p0質粒，并連接兩酶切產物得到含有潮霉素轉磷酸移酶為篩選標記的整合型表達載體p0(hph)；（2）構建重組整合型表達質粒：根據NCBI公開的序列，全化學合成丙酮酸脫氫酶E1組分α亞基的編碼基因，并通過限制內切酶Not?I和Eco?RI同時切割獲得的開放閱讀框部分和整合型表達載體p0(hph)，連接獲得重組表達質粒p0(hph)-PDA1；（3）將所得重組質粒轉化Y.lipolytica?WSH-Z06：利用電穿孔轉化方法將被限制性內切酶Avr?II線性化的重組整合型表達質粒轉化野生型Y.lipolytica?WSH-Z06，驗證篩選陽性轉化子。?

質粒p0的構建方法參見文獻：Swennen?D,Paul?MF,Vernis?L,Beckerich?JM,Fournier?A,Gaillardin?C.Secretion?of?active?anti-Ras?single-chain?Fv?antibody?by?the?yeasts?Yarrowia?lipolytica?and?Kluyveromyces?lactis.Microbiology-Sgm,2002.148:41-50。?

一種以所述基因工程菌發酵生產α-酮戊二酸的方法，是將所得重組基因工程菌接種至種子培養基中，28℃、200rpm，培養16-18小時；按10%的接種量從種子培養基中接種到3-L發酵罐中，培養溫度為28℃、通氣量為1.5vvm，攪拌轉數為400rpm，培養144-168小時。?