[發(fā)明專利]一種強(qiáng)化前體供應(yīng)增強(qiáng)α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410093771.X
• 申請(qǐng)日: 2014-03-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103923847A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);周景文;郭洪偉;堵國(guó)成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/19
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12P7/50;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種強(qiáng)化前體供應(yīng)增強(qiáng)α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母（Yarrowia?lipolytica）基因工程菌，其特征在于，是在解脂亞洛酵母中過(guò)量表達(dá)編碼丙酮酸脫氫酶E1組分α亞基的基因pda1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因pda1的核苷酸序列為NCBI中GeneID:2908574所示的核苷酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是以解脂亞洛酵母CCTCCNO：M20714為宿主，以含有潮霉素轉(zhuǎn)磷酸移酶為篩選標(biāo)記的整合型表達(dá)載體p0(hph)為表達(dá)載體。

4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，步驟為：（1）構(gòu)建表達(dá)目的基因所用的整合型表達(dá)載體：擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，利用限制性內(nèi)切酶Stu?I與Hind?III同時(shí)處理擴(kuò)增得到的hph基因和p0質(zhì)粒，并連接兩酶切產(chǎn)物得到含有潮霉素轉(zhuǎn)磷酸移酶為篩選標(biāo)記的整合型表達(dá)載體p0(hph)；（2）構(gòu)建重組整合型表達(dá)質(zhì)粒：根據(jù)NCBI公開(kāi)的序列，全化學(xué)合成編碼丙酮酸脫氫酶E1組分α亞基的基因的開(kāi)放閱讀框序列，并通過(guò)限制內(nèi)切酶Not?I和Eco?RI同時(shí)切割獲得的開(kāi)放閱讀框部分和整合型表達(dá)載體p0(hph)，連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒；（3）將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y.lipolytica?WSH-Z06：利用電穿孔轉(zhuǎn)化方法將被限制性內(nèi)切酶AvrII線性化的重組整合型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型Y.lipolytica?WSH-Z06，驗(yàn)證篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

5.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，是將所得重組基因工程菌接種至種子培養(yǎng)基中，28℃、200rpm培養(yǎng)16-18小時(shí)；按10%的接種量從種子培養(yǎng)基中接種到3-L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為28℃、通氣量為1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為400rpm，培養(yǎng)144-168小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1g/L，調(diào)pH為5.5。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：甘油100g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O1.2g/L，NaCl0.5g/L，K₂HPO₄0.1g/L，鹽酸硫胺素2×10^-7g/L，調(diào)pH為5.0后再加入20g/LCaCO₃。

8.一種強(qiáng)化酵母合成α-酮戊二酸的方法，其特征在于，是通過(guò)過(guò)量表達(dá)丙酮酸脫氫酶E1組分α亞基的編碼基因pda1強(qiáng)化丙酮酸脫氫酶活力，促進(jìn)丙酮酸脫氫形成乙酰-CoA，強(qiáng)化進(jìn)入三羧酸循環(huán)的碳代謝流，為酵母合成α-酮戊二酸增加前體供應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述酵母為解脂亞洛酵母（Yarrowia?lipolytica）。