[發明專利]一種從海洋微生物發酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法

有效

• 申請號: 201410093680.6
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103911394B
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 王蔚;李芊;楊慧;陳卓;胡彬;陳建明
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/533
• 分類號: C12Q1/533;C12P1/02
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 戚東升

本發明公開了一種從海洋微生物發酵液中篩選1?脫氧木酮糖?5磷酸消旋酶抑制劑的方法，具體為，1）海洋微生物發酵液樣品的制備：接種真菌，發酵，提取代謝產物，濃縮，洗脫；2）以創傷弧菌全基因組為模板，設計引物PCR擴增后，克隆入載體，轉化大腸桿菌后誘導目的蛋白表達，目的蛋白經洗脫，透析，超濾，除鹽得到His?DXR；3）將菌懸液、刃天青溶液和1）所得進行反應后測定其熒光值并通過公式計數出抑制率，篩選出抑制率在80%以上的餾分；4）將步驟3）篩選的餾分與步驟2）所得His?DXR進行反應，計算抑制率；篩選出抑制率≥50%的餾分。本方法簡單準確，為發現以Dxr為靶點的新型抗菌藥物或先導化合物奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種從海洋微生物發酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法。

背景技術

自1929年弗萊明從真菌中發現了青霉素以來，微生物活性代謝產物成為了藥物發現的重要資源。青霉素的應用標志著抗生素時代的開始，越來越多的陸源微生物代謝產物被開發成天然藥物。在過去的70多年里，已經從微生物中發現了約30000-50000種天然產物，其中10000多種有生物活性，8000多種是抗菌和抗腫瘤劑，據不完全統計至今已有100多種由微生物生產并應用于臨床的農藥、抗腫瘤劑和抗生素，每年全球抗生素產量超過10萬噸，產值超過50多億（五株海洋真菌次生代謝產物及其生物活性研究，2010）。然而，在對陸源微生物的長期研究開發過程中，從陸生微生物次級代謝產物中發現新的先導化合物或抗生素的難度越來越大，而抗藥性問題的日益嚴重使新藥的開發面臨著嚴峻挑戰。

海洋覆蓋地球表面積的71%，是生命的起源地。動物界中28個主要動物門有26個是生活在水中，其中還有8個門為完全水生，估計海洋動物約有50多萬種。海洋生物中海洋微生物由于其生活在寡營養、弱堿性的含鹽海洋環境中，為了維持其生命活動，形成了獨特的耐饑、耐堿和耐鹽等生理特征和代謝機制，在生長和代謝過程中產生了有別于陸地微生物的大量結構新穎、活性強的次生代謝產物。另外，由于海洋微生物具有生長周期短、不受季節及自然生物量等方面的限制、可人工大規模培養等優勢，理所當然的受到越來越多的重視。就尋找新的化合物和抗生素而言，目前僅有1%左右的海洋微生物被分離鑒定，具有產生新型生物活性物質的巨大潛力，人們對于從中尋找新的特效藥物寄予了極大的希望。

近年來,隨著分子生物化、學生物學、生物信息學等學科的發展,對萜類化合物的研究日趨深入,它的生物合成途徑也逐漸清晰,已得到克隆和分析了許多關鍵酶基因。其中包括萜類生物合成途徑中的相關酶之一：脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構酶(DXR)，DXR催化DXP生成MEP,是DXP途徑的限速酶。DXR是潛在的抗瘧藥物、抗生素和除草劑的靶標位點,而且是一個更有效率的靶標位點。Kuntz等(2005)報道,膦胺霉素(fosmidomycin)是傳統的DXR抑制劑,在2個新型DXR抑制劑4-(hydroxyamino)-4-oxobutylphosphonicacid和4-[hydroxy(methyl)amino]-4-oxobutylphosphonicacid中,其中后者表現出很高的抑制DXR的活性。在細菌、藻類、植物和原生動物中已發現存在DXR,但目前在人體中還未找到,因此用DXR這一靶標位點研制抗菌和抗瘧藥物更加引起了人們的興趣。在研究擬南芥的DXR基因中,Rohdich等(2006)將去除N端轉運肽序列后的重組體在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達,通過親和色譜法得到的純化蛋白可用DXP催化形成MEP,催化速率為5.6molmin-1mg-1(蛋白),此反應需NADPH參與，需要二價金屬離子Mn²⁺和Mg²⁺,最適pH值為8.0,NADPH雖然可用NADH替代,但替代后的反應速率降至原來的14%。