[發明專利]一種從海洋微生物發酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法

有效

• 申請號: 201410093680.6
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103911394B
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 王蔚;李芊;楊慧;陳卓;胡彬;陳建明
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/533
• 分類號: C12Q1/533;C12P1/02
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 戚東升

1.一種從海洋微生物發酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟，

1)海洋微生物發酵液樣品的制備：海水PDA液體培養基接種真菌，培養后作為種子液繼續發酵，待真菌發酵成熟后，提取代謝產物；并提取胞內物質，提取的液體濃縮至浸膏，得到初級浸膏；

初級浸膏利用正相硅膠柱進行等度洗脫，根據信號峰出峰的時間收集洗脫液，減壓濃縮，得到初級餾分；

初級餾分使用反相C18制備柱進行梯度洗脫，根據信號峰出峰的時間收集洗脫液，減壓蒸餾至浸膏，得到次級餾分，次級餾分溶于DMSO使之達到次級餾分蒸餾前的體積即為海洋微生物發酵液樣品；

2)His-DXR的制備：以創傷弧菌全基因組為模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進行PCR擴增后，克隆入pET-22b載體得到重組質粒pET22b-DXR；將重組質粒pET22b-DXR轉化大腸桿菌后用IPTG誘導，離心收集菌體細胞后重懸，進行超聲裂解菌體，離心收集上清，將上清經過Ni²⁺-NTA親合層析柱洗脫，收集到目的蛋白溶液His-DXR并溶于透析液中，用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Devices反復離心超濾除鹽，得到His-DXR；

3)抑菌活性篩選：將175μL菌懸液、20μL刃天青溶液和5μL步驟1)所得海洋微生物發酵液樣品同時加入到96微孔板中；同時設定陰性和陽性對照，恒溫培養箱中培養24小時后，在酶標儀中的激發波長為530nm，發射波長為590nm處測定其熒光值，并通過公式計數出抑制率，篩選出抑制率在80％以上的餾分留做下一步酶活篩選；

所述菌懸液為輪蟲弧菌或坎式弧菌或創傷弧菌懸液；陰性對照為：5μL DMSO+175μL菌懸液+20μL刃天青；陽性對照為：5μL DMSO+175μL LB+20μL刃天青；

4)酶活抑制試驗篩選：將步驟3)篩選出的餾分溶于DMSO中配置待篩選餾分，在含有Tris-HCl緩沖液，MgCl₂，DTT，NADPH及DXP，一定pH的反應液中，分別加入待篩選餾分，加入步驟2)所得His-DXR開始反應，在340nm下測定吸光值，設置對照和空白組，對照組以DMSO代替待篩選餾分，空白組不加His-DXR，重復三次，計算抑制率；≥50％的酶活抑制率的餾分即為篩選到的1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑；

所述抑制率的計算公式為：抑制率％＝100％-(實驗孔熒光值-陽性對照熒光值)/(陰性對照熒光值-陽性對照熒光值)×100％。

2.權利要求1所述從海洋微生物發酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟1)中，海洋微生物發酵液樣品的制備為海水PDA液體培養基接種真菌，培養后作為種子液；大米固體發酵培養基進行發酵，待真菌發酵成熟后，采用乙酸乙酯浸泡發酵產物，提取代謝產物，反復提取3次，每次浸泡24h；并采用高壓乳化切割機以乙酸乙酯為溶劑處理發酵產物，提取胞內物質，提取的液體采用旋轉蒸發儀減壓濃縮至浸膏，得到初級浸膏；

初級浸膏利用正相硅膠柱，設置正己烷，乙酸乙酯比例進行等度洗脫，通過紫外檢測器檢測信號，220nm下接收信號，根據信號峰出峰的時間收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮，得到初級餾分；

初級餾分使用反相C18制備柱進行次級餾分的制備，設置乙腈：水梯度洗脫條件，通過紫外檢測器檢測信號，220nm下接收信號，根據信號峰出峰的時間收集洗脫液，減壓蒸餾至浸膏，得到次級餾分，次級餾分溶于DMSO使之達到次級餾分蒸餾前的體積即為海洋微生物發酵液樣品。