[發(fā)明專利]扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410091274.6
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN103866021A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬嘯;張新全;郭志慧;彭燕;劉偉;閆艷紅;周朝杰;顧曉燕;劉新
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

扁穗牛鞭草(Hemarthria?compressa?L.)是禾本科牛鞭草屬多年生暖季型優(yōu)良飼草，莖葉量多，草質(zhì)柔嫩，營養(yǎng)豐富，富含果膠、植物膠汁、藻類多糖和部分纖維素等水溶性纖維素而入口微甜，既可放牧利用，又可調(diào)制干草、青貯。牲畜喜食用，主要靠地上莖繁殖，具有適應(yīng)性廣、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、耐刈割、適口性好、高抗及競爭性強的優(yōu)點，對退耕還草、種草養(yǎng)畜、水土保持及環(huán)境綠化等具有重要應(yīng)用價值。?

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立和成熟，為發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定技術(shù)提供了有效手段。ISAP(intron?sequence?amplified?polymorphism)標(biāo)記技術(shù)一種基于基因中內(nèi)含子序列的功能型分子標(biāo)記，利用內(nèi)含子剪接位置的保守一致序列作為其引物的核心序列，其上下游引物均為18bp，上下游引物間通過組合配對的方式作為擴增的引物對，對真核生物的基因序列進行擴增的分子標(biāo)記。ISAP標(biāo)記通過對基因序列的擴增而與表達序列緊密連鎖，可以被廣泛而高效地應(yīng)用于高密度圖譜的構(gòu)建，QTL檢測，基因定位，圖位克隆以及分子標(biāo)記輔助育種等。?

由于扁穗牛鞭草為無性繁殖，其品種選育一般通過選擇具有優(yōu)良遺傳變異的無性系材料。這也為其品種或優(yōu)良品系的知識產(chǎn)權(quán)保護帶來挑戰(zhàn)。DNA指紋圖譜技術(shù)正是基于每種植物及其品種都有各自特定的性狀和相應(yīng)的DNA序列差異而建立的應(yīng)用性遺傳分析方法，通過對已有各品種或品系DNA進行掃描并編碼登記形成各自獨特的指紋圖譜鑒定某個品種或品系的真?zhèn)魏吞禺愋浴ｉ_?展扁穗牛鞭草種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜構(gòu)建研究，可以有效地解決同種異名、同名不同質(zhì)和疑似近似品種的管理問題，為其品種審定和保護提供重要理論參考依據(jù)。目前，未見ISAP標(biāo)記技術(shù)在扁穗牛鞭草無性系DNA指紋圖譜方面的研究，也沒有建立一種完善的扁穗牛鞭草DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用。?

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：?

扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟：?

1.DNA提取：采用CTAB法提取扁穗牛鞭草基因組DNA；?

2.ISAP引物序列的PCR擴增：在Bio-Rad?icycler?PCR儀上進行PCR擴增，對72對引物進行多態(tài)性篩選；?

3.ISAP-PCR產(chǎn)物的電泳檢測：用6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上電泳，銀染法后拍照，得照片；?

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析：在相同遷移位置，人工記錄每個引物的擴增片段，有帶記為1，無帶記為0，形成原始“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣；?

5.DNA指紋圖譜的構(gòu)建：根據(jù)照片上引物擴增情況，挑取具有代表性的ISAP多態(tài)性帶，繪制扁穗牛鞭草的DNA指紋圖譜。?

所述步驟1中DNA提取包括如下步驟：?

(1)取適量植物組織置于研缽中，加入約30mL的液氮，搗碎葉片，等液氮快揮發(fā)完時，快速研磨到粉狀，把粉末轉(zhuǎn)移到有標(biāo)記的2.0ml無菌離心管中；加入800μL65℃預(yù)熱的DNA提取液于2.0ml無菌離心管中，迅速顛倒混勻后，將離心管置于65℃水浴20-60min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；取出樣品管按體積比24∶1加入700μL氯仿／異戊醇顛倒充分混勻后，12000rpm離心5min，得上清液；?

(2)將步驟(1)所得的上清液吸取到一個新的1.5mL無菌離心管；緩慢?加入預(yù)冷的異丙醇，加入量按吸取上清液體積的2／3計，上下?lián)u動離心管，注意觀察DNA將從溶液中析出，-20℃放置30min，使得DNA成團，12000rpm離心5min，將析出的白色絮狀DNA沉淀轉(zhuǎn)入新的1.5mL無菌離心管；加入75％的乙醇溶液900μL，清洗2-3次，混勻，4℃，12000rpm離心6min，倒掉上清液，然后用無水乙醇洗滌一次，室溫下放置數(shù)分鐘；加入500μL的TE緩沖液，37℃保溫1h以除去DNA中的RNA；在無菌離心管加入500μL苯酚、氯仿和異戊醇的混合物，氯仿和異戊醇的混合物各抽提一次，充分混勻，在室溫下12000rpm，離心5min；?