[發(fā)明專利]扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410091274.6
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN103866021A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設計）人: 馬嘯;張新全;郭志慧;彭燕;劉偉;閆艷紅;周朝杰;顧曉燕;劉新
• 申請（專利權）人: 四川農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：?

(1).DNA提取：采用CTAB法提取扁穗牛鞭草基因組DNA；?

(2).ISAP引物序列的PCR擴增：在Bio-Rad?icycler?PCR儀上進行PCR擴增，對72對引物進行多態(tài)性篩選；?

(3).ISAP-PCR產物的電泳檢測：用6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上電泳，銀染法后拍照，得照片；?

(4).數(shù)據統(tǒng)計及分析：在相同遷移位置，人工記錄每個引物的擴增片段，有帶記為1，無帶記為0，形成原始“0，1”二元數(shù)據矩陣；?

(5).DNA指紋圖譜的構建：根據照片上引物擴增情況，挑取具有代表性的ISAP多態(tài)性帶，繪制扁穗牛鞭草的DNA指紋圖譜。?

2.根據權利要求1所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟1中DNA提取包括如下步驟：?

(1)取適量植物組織置于研缽中，加入約30mL的液氮，搗碎葉片，等液氮快揮發(fā)完時，快速研磨到粉狀，把粉末轉移到有標記的2.0ml無菌離心管中；加入800μL65℃預熱的DNA提取液于2.0ml無菌離心管中，迅速顛倒混勻后，將離心管置于65℃水浴20-60min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；取出樣品管按體積比24∶1加入700μL氯仿／異戊醇顛倒充分混勻后，12000rpm離心5min，得上清液；?

(2)將步驟(1)所得的上清液吸取到一個新的1.5mL無菌離心管；緩慢加入預冷的異丙醇，加入量按吸取上清液體積的2／3計，上下?lián)u動離心管，注意觀察DNA將從溶液中析出，-20℃放置30min，使得DNA成團，12000rpm離心5min，將析出的白色絮狀DNA沉淀轉入新的1.5mL無菌離心管；加入75％的乙醇溶液900μL，清洗2-3次，混勻，4℃，12000rpm離心6min，倒掉上清液，然后用無水乙醇洗滌一次，室溫下放置數(shù)分鐘；加入500μL的TE緩沖液，?37℃保溫1h以除去DNA中的RNA；在無菌離心管加入500μL苯酚、氯仿和異戊醇的混合物，氯仿和異戊醇的混合物各抽提一次，充分混勻，在室溫下12000rpm，離心5min；?

(3)取上清液于另已1.5ml無菌離心管中，加入200μL5mol／L的NaCl和750μL飽和水乙醚，輕搖5min，在室溫下12000rpm，離心10min；小心除去上層乙醚，將下層液體移到鑫的1.5ml無菌離心管中，加入1／10體積的NaAc和兩倍體積無水乙醇，-20℃沉淀DNA1h；12000rpm離心10min，沉淀用70％乙醇、無水乙醇各洗滌1次，室溫放置5min；?

干燥后加入150-200μL雙蒸水或0.1×TE緩沖液，放在4℃冰箱中保存；?

(4)采用紫外分光光度計法檢測DNA的含量，檢測260、280nm處的OD值，計算得出DNA的含量。如OD260／OD280=1.8左右，DNA較為純凈；<1.8，則有蛋白污染；>1.8，則有RNA污染。同時，還可進一步用1％的瓊脂糖電泳檢測DNA的質量，以得到非常直觀的效果。?

3.根據權利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述DNA提取為2％CTAB；1.4mol／LNaCl；20mmol／L?EDTAPH8.0；100mmol／LTris-HClPH8.0；2％β-巰基乙醇。?

4.根據權利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述TE緩沖液為10mmol／L?Tris-HCl，1mmol／LEDTA，PH8.0)溶解，加入3μLRNAase(10mg／ml。?

5.根據權利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(2)中苯酚∶氯仿∶異戊醇的體積比為25∶24∶1。?

6.根據權利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(2)氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1。?

7.如權利要求1所述扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法的應用。?