[發明專利]cDNA的合成方法

在審

• 申請號: 201410089861.1
• 申請日: 2014-03-12
• 公開（公告）號: CN104046613A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 齊藤祐司;高城富美男
• 申請（專利權）人: 精工愛普生株式會社
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 金世煜;苗堃

技術領域

本發明涉及一種cDNA的合成方法。

背景技術

Boom等報告了使用二氧化硅粒子等核酸結合性固相載體和離液劑，從生物體材料更簡便地提取核酸的方法（參照非專利文獻1）。而包含Boom等方法在內的使用二氧化硅等核酸結合性固相載體和離液劑將核酸吸附在載體上而提取的方法，主要由以下3工序組成：（1）離液劑的存在下，使核酸吸附于核酸結合性固相載體的工序（吸附工序）、（2）為了除去非特異性結合的夾雜物和離液劑，通過清洗液將吸附核酸的載體清洗的工序（清洗工序）、以及（3）通過水或低鹽濃度緩沖液將核酸從載體溶出的工序（溶出工序）。其中作為（2）的清洗液，溶解有離液劑且為了防止核酸從載體的溶出而一直以來使用水溶性有機溶劑，特別是以50～80%左右的比例含有乙醇的水或低鹽濃度緩沖液。

但是，該水溶性有機溶劑在（3）的工序中殘留時，由于在將提取液進行酶處理時阻礙酶反應，通常，在用含有乙醇的水溶液進行清洗之后，根據需要進行用100%乙醇、或者、揮發性更高的丙酮等清洗，然后，進行干燥將有機溶劑從體系中完全去除的操作。已知該干燥不僅需要時間，而且如果干燥時間不充分會導致乙醇的殘留，干燥過度時，由于核酸干燥過度而固化，溶出變得困難，結果導致核酸回收量的降低、重現性降低。因此有機溶劑的使用，不僅很難估計其干燥的程度，而且由于乙醇、丙酮這樣的有機溶劑具有易燃性和揮發性，特別是考慮操作的自動化時，存在起火等的危險性。

因此，開發了載體吸附核酸之后，（2）的清洗工序中，使用完全不含乙醇等有機溶劑的水或低鹽濃度緩沖液清洗載體，（3）的溶出工序中，50～70℃下，通過用水或低鹽濃度緩沖液將核酸溶出，提取核糖核酸（RNA）的方法（參照專利文獻1）。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1日本特開平11-146783號公開公報

非專利文獻

非專利文獻1J.Clin.Microbiol.,vol.28No.3,p.495-503(1990)

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠效率良好地利用的cDNA的合成方法。

目前為止，Boom法中，將核酸吸附于載體，（2）的清洗工序中，用實際上不含乙醇等機溶劑的水或低鹽濃度緩沖液清洗載體之后，（3）的溶出工序中，50～70℃下，通過用水或低鹽濃度水溶液溶出核酸，將核糖核酸（RNA）分離（日本特開平11-146783號公開公報）。但是，本發明者發現將用Boom法分離的RNA用于RT-PCR時，通過將吸附于載體的RNA，在不從載體游離的秦光下進行逆轉錄反應，從而能夠將合成的cDNA直接溶出至PCR反應液中，可效率良好地進行之后的PCR反應，從而實現了本發明的完成。

本發明的一個實施方式是一種cDNA合成方法，其具有以下工序：吸附工序，在含有核糖核酸（RNA）的試樣中，混合含有離液物質的溶解液和核酸結合性固相載體，將RNA吸附于所述載體上；逆轉錄工序，將吸附于所述載體的RNA，在逆轉錄反應液中在吸附于所述載體的情況下進行逆轉錄，合成cDNA；溶出工序，將合成的所述cDNA溶出至溶出液中。可以在逆轉錄工序之前或之后進一步具有將吸附上述RNA的所述載體用不含有機溶劑的清洗液清洗的工序。上述逆轉錄反應液可以含有逆轉錄酶、dNTP、逆轉錄用引物。上述溶出液可以含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA擴增用引物。上述逆轉錄反應液和/或溶出液可以含有BSA。此外，上述逆轉錄工序中，優選在小于50℃的條件下將上述RNA逆轉錄。上述載體優選為磁性粒子。

本發明的另一實施方式是一種cDNA合成試劑盒，其含有：含4～7M的胍鹽、0～5%的非離子性表面活性劑、0～0.2M的還原劑的中性溶解液，核酸結合性固相載體；含4～7M的胍鹽、0～5%的非離子性表面活性劑的第1清洗液；由水或低鹽濃度水溶液組成的第2清洗液；含有逆轉錄酶、dNTP以及逆轉錄用引物的逆轉錄反應液；含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA擴增用引物的DNA擴增液。

通過本發明，能夠提供一種能夠效率良好地利用的cDNA的合成方法。

附圖說明

圖1是表示使用本發明的一個實施例中通過在載體上進行逆轉錄反應而合成的cDNA進行PCR反應的結果的圖。

圖2是表示本發明的一實施例中在載體上進行逆轉錄反應之后，省略清洗工序進行PCR反應的結果的圖。

具體實施方式