[發明專利]一種基于LAMP技術快速檢測多菌靈高抗核盤菌菌株的方法

有效

• 申請號: 201410089651.2
• 申請日: 2014-03-12
• 公開（公告）號: CN103820563A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 周明國;段亞冰;葛常艷;張曉柯
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明是基于環介導恒溫擴增技術(1oop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)對多菌靈高抗核盤菌菌株的快速分子檢測，可用于核盤菌對多菌靈抗性群體發展的動態監測與抗性風險評估，進行抗藥性油菜菌核病的流行預警，為油菜菌核病的防治提供用藥指導。

背景技術

環介導恒溫擴增反應(LAMP)是2000年由日本學者Notomi等發明的一種新穎的恒溫核酸體外擴增技術，廣泛應用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術原理是：利用一套(4種)特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60～65℃范圍60min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物——白色的焦磷酸鎂沉淀產生。羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑，根據反應液中鎂離子的變化而呈現出不同的顏色，陰性(沒有擴增出產物)時為紫色，陽性(有產物擴增)時為天藍色。LAMP方法的最大特點就是實現恒溫擴增，不需要循環儀等昂貴的儀器；擴增反應極快，一般在1小時內完成；擴增產生的產物量大，通過肉眼即可判定結果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強；操作簡便、快捷，極適于病原的快速診斷及檢測。

油菜菌核病是由核盤菌(Sclerotinia?sclerotiorum)引起的一種分布較廣、破壞性較強的世界性病害。該病菌寄主范圍非常廣泛，能侵染包括75科278屬408種及42個變種或亞種植物，給農作物的產量和質量造成了嚴重的經濟損失。多年來一直使用以多菌靈為主的苯并咪唑類殺菌劑防治油菜菌核病，據報道，油菜菌核病菌已對多菌靈產生抗性，且抗性菌株分布范圍逐年擴大，抗性群體比例不斷上升，最終導致了多菌靈田間防效下降。經過多年的研究，南京農業大學植物藥理學和病害防控實驗室發現核盤菌對多菌靈的抗藥性菌株主要是由β-微管蛋白基因(SS1G_04652.3)第198或200位氨基酸密碼子突變造成，第198位氨基酸密碼子GAG(Glu)→GCG(Ala)的突變對多菌靈表現為高抗，第200位氨基酸密碼子TTC(Phe)→TAC(Tyr)的突變對多菌靈表現為低抗。其中第198位突變類型占所有抗藥性突變類型總量的90％以上，成為病原菌產生田間抗藥性的主要原因。

病原菌在自然界的數量巨大，抗藥性個體在群體中的比例達到3％時，即可引起抗藥性病害流行，導致藥劑防治失敗。傳統的檢測方法需要分離培養病原菌，然后用含藥培養基上培養，再根據藥劑對菌絲生長的抑制作用鑒別抗藥性。本發明在抗藥性機制研究的基礎上，基于LAMP技術快速、準確檢測核盤菌對多菌靈的抗藥性。該檢測方法具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點，能顯著提高檢測效率，對菌核病的有效防治、抗藥性流行預警具有重要的現實意義。然而，經檢索目前國內外尚未有核盤菌對多菌靈抗性菌株的LAMP快速分子檢測的相關報道。

發明內容

已報道的核盤菌對多菌靈抗性菌株的鑒定及檢測方法存在費時、費力、成本高等缺點。針對這一缺點，根據核盤菌對多菌靈抗性菌株的基因型，通過實驗條件優化，建立了一種快速檢測多菌靈高抗核盤菌菌株的方法。該方法具有簡便、快速、省時省力、靈敏度高等特點，對菌核病的合理用藥、控制病害發生與流行、減少經濟損失具有實用價值。

田間檢測的多菌靈高抗核盤菌菌株的突變類型是由核盤菌β-微管蛋白基因編碼的第198位氨基酸密碼子突變造成的。本發明所述的快速檢測多菌靈高抗核盤菌菌株的分子生物學方法，步驟是：

(1)在多菌靈高抗核盤菌菌株的β-微管蛋白基因上(包括198位氨基酸的序列)設計1對外引物和1對內引物，利用該引物在恒溫條件下，進行LAMP擴增；

①LAMP反應所用的外引物對：

F3：TCGCCAAAGGTTTCCGATAC

B3：ACCAGGGAAACGGAGACAG

②LAMP反應所用的內引物對(含人為引入錯配堿基)：

FIPGGCGTCAGAGTTCTCGACCA?ACGTCGTCGAGCCATATAACG

BIP：CGTCAGAGTTCTCGACCAACGTCGTCGAGCCATATAACG

③LAMP反應體系及其條件：

反應體系(10μL)：

反應條件：

63℃60min，80℃10min；

(2)對上述LAMP擴增產物觀察其顏色變化，并在3.0％瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀察擴增結果；