[發(fā)明專利]禾谷縊管蚜ACT1內參基因部分序列、克隆方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410088424.8
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103820462A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設計）人: 王錫鋒;武科科;劉艷
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及禾谷縊管蚜參照基因ACT1基因部分序列、克隆方法及其作為內參基因在RT-qPCR中的應用。

背景技術

禾谷縊管蚜（Rhopalosiphum?padi?L.，RP）隸屬于同翅目蚜科(Homoptera:Aphididae)。這種蚜蟲在世界范圍廣泛分布，是禾本科植物重要的害蟲之一。除了能通過吸食植株營養(yǎng)而直接影響谷物產(chǎn)量外，它主要是做為禾本科作物和雜草病毒病的傳播介體造成危害。禾谷縊管蚜以持久性非增殖方式傳播黃矮病毒，是黃癥病毒科黃癥病毒屬多種大麥黃矮病毒的優(yōu)勢傳毒介體。

在禾谷縊管蚜刺吸取食受黃矮病感染的植株韌皮部汁液的同時，它也取食到了存在于韌皮部病毒粒體。在介體蚜蟲的中腸和/或后腸以及唾液腺中發(fā)生受體介導的胞吞胞吐。黃矮病在寄主植物體內的增殖一般地采用絕對和相對定量的方法，但是還沒有關于在獲毒期，接毒期以及影響傳毒效率、傳毒周期田間植物病毒流行的所有關鍵時期的介體體內病毒的滴度和積累變化的研究報道。病毒進入介體蚜蟲體內后，伴隨著無數(shù)的基因表達呈上調或下調，許多蛋白通過一種轉胞吞的方式被整合成與病毒傳播相關。應用反轉錄實時定量PCR(RT-qPCR)，我們能迅速地評價分子功能和生物學過程中病毒的影響以及病毒的實時濃度。

近年來，定量PCR（qPCR）中相對定量的方法較為流行，它消除了在實驗處理間、RNA提取效率及RNA完整性方面等系統(tǒng)誤差，應用到了分子研究工作的許多方面。在生物體中，看家基因（House-keeping?gene）在所有細胞中都是保守的，在正?；蚍钦Ｇ闆r下都是持續(xù)表達的。因此，在RT-qPCR實驗中，選擇適合的、可信的看家基因作為內參基因是必不可少的。隨著果蠅（Drosophila?melanogaster）和小菜蛾（Plutella?xylostella?L.）等不同的昆蟲全基因組序列的發(fā)表，尋找看家基因作為內參基因成為這些完全變態(tài)昆蟲的研究重點之一。在運用RT-qPCR分析昆蟲基因表達的實驗中通常用下列內參基因，如18S?rRNA,ACT1,EF-1α,GAPDH,UBI,RPSs,RPLs和TUB等。對于不完全變態(tài)昆蟲，特別是傳播多種植物病毒的蚜蟲，近年來開展了大豆蚜（Aphis?glycines）看家基因的研究。對于監(jiān)測介體禾谷縊管蚜體內病毒基因的變化，用RT-qPCR確定病毒基因表達的相對水平，還沒有找到有效適用的看家基因。盡管有研究中ACT1基因已被用來作為檢測禾谷縊管蚜中兩種植物病毒的內參基因，但這個基因實際上是參考家蠶(Bombyx?mori)的、并不是禾谷縊管蚜自身的ACT1基因，而本發(fā)明的結果也證實了兩個物種的ACT1基因在核苷酸序列上確實存在一定的差異。所以在定量禾谷縊管蚜體內的病毒含量時，使用其它物種的基因作為內參基因的做法是不準確的。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供禾谷縊管蚜ACT1基因片段，可作為禾谷縊管蚜內參基因的應用。

并同時提供克隆禾谷縊管蚜的ACT1的特異性引物，建立基于SYBR?Green?I染料技術的RT-qPCR方法，從而為禾谷縊管蚜的ACT1作為內參基因，在利用qPCR對禾谷縊管蚜功能基因或作為傳毒介體病毒在體內增殖變化的研究中提供有用的方法。

禾谷縊管蚜ACT1基因片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

一種禾谷縊管蚜ACT1基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷縊管蚜基因組總RNA，采用引物ACT1R進行RT-PCR擴增，以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板、以引物對ACT1F/ACT1R進行PCR擴增，得到陽性克隆，最后經(jīng)測序驗證。其中引物序列為：

ACT1F:5′-ATGTGTGACGAAGAAGTAGC-3′；

ACT1R:5′-TTAGAAGCACTTTCTGTGC-3′。

所獲得的目的片段大小為1131bp。

所述PCR擴增的反應條件如下：94℃3min、[94℃45s、56℃1min、72℃1min]30個循環(huán)、72℃延長10min，4℃保存。

本發(fā)明還提供一種qPCR擴增ACT1基因部分序列的方法，抽提禾谷縊管蚜基因組總RNA，以試劑盒中自帶的引物混合物為引物進行RT反應，然后以產(chǎn)物第一鏈cDNA作為模板進行定量PCR擴增，熒光染料為SYBR?Green?I，其中定量PCR擴增中的禾谷縊管蚜的定量引物，其序列為：

QACT1F：5′-AACGGAAGCACCTTTGAACC-3′；

QACT1R：5′-GGAAGAAGCAGCAGTAGCCAT-3′。