[發(fā)明專利]一種胃液中l(wèi)ncRNA的提取與檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410088376.2
• 申請(qǐng)日: 2014-03-11
• 公開（公告）號(hào): CN103834738A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭俊明;邵永富;肖丙秀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 寧波誠(chéng)源專利事務(wù)所有限公司 33102
• 代理人: 徐雪波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種lncRNA的提取與檢測(cè)方法，尤其涉及一種胃液中l(wèi)ncRNA的提取與檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

人體中編碼蛋白質(zhì)的基因大約有2～3萬個(gè)，僅占人類基因組的2%，其余98%不編碼蛋白質(zhì)的基因組DNA最初被認(rèn)為是沒有功能的，是生物體中的垃圾，通常被稱為“垃圾DNA”(junk?DNA)。但目前的研究表明，這些垃圾DNA大多可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼RNA(noncoding?RNA，ncRNA)，隨著高通量全基因組測(cè)序技術(shù)的普遍應(yīng)用，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中約98%的轉(zhuǎn)錄物為ncRNA。在這些ncRNA分子中有包括目前人們所熟知的“看家(housekeeping)”ncRNA(如tRNA和rRNA等)、小ncRNA(如microRNA和piRNA等)，而更多的則是尚待深入研究的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long?noncoding?RNA，lncRNA)分子。

lncRNA是指一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)并且不具備編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子。這類分子一般具有高度保守的序列元件、特定的空間二級(jí)結(jié)構(gòu)、剪切形式和亞細(xì)胞定位，特別是它們中的許多成員被發(fā)現(xiàn)具有組織或細(xì)胞特異性。這種保守性和特異性決定了lncRNA具有廣泛的生物學(xué)功能，涉及染色體結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化、端粒維持、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成、基因組印跡、劑量補(bǔ)償效應(yīng)等生命過程。正因?yàn)槿绱耍琹ncRNA不能再被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”和RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，而是一類具有重要生物學(xué)功能的新型ncRNA分子。

對(duì)于ncRNA結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能的研究，離不開各類體液ncRNA的提取、RNA質(zhì)量鑒定及其檢測(cè)。目前胃液中ncRNA的提取與檢測(cè)方法如一申請(qǐng)?zhí)?01010606089.8(公告號(hào)為CN102127601A)的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)《一種胃液中miRNA的檢測(cè)方法》就公開了操作步驟，具體包括胃液抽取和氫氧化鈉溶液中和、胰蛋白酶消化、加Trizol試劑混勻靜置、RNA釋放、氯仿提取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌、RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR檢測(cè)等步驟。

上述方法解決了胃液中酸度、多糖和粘蛋白等對(duì)miRNA提取的干擾問題。然而，由于Trizol試劑只適合組織樣本總RNA的提取，況且miRNA分子遠(yuǎn)小于lncRNA分子，前者只有20多個(gè)nt，假如采用類似提取miRNA的方法用于胃液中l(wèi)ncRNA的提取則明顯存在操作步驟復(fù)雜、RNA產(chǎn)率低的缺陷。同時(shí)室溫下lncRNA性質(zhì)較不穩(wěn)定，而胃液中又存在相當(dāng)數(shù)量的核酸酶，所以lncRNA是極易在提取中降解。以上因素均能嚴(yán)重影響胃液lncRNA的質(zhì)量。

此外，胃液中l(wèi)ncRNA豐度低，對(duì)胃液lncRNA的提取和檢測(cè)難度較大，截至目前仍沒有完善的提取、檢測(cè)胃液中l(wèi)ncRNA技術(shù)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種胃液中l(wèi)ncRNA的提取與檢測(cè)方法，該方法能去除胃液中多糖和粘蛋白等雜質(zhì)的干擾，實(shí)現(xiàn)了胃液中l(wèi)ncRNA高質(zhì)量、高含量提取，并對(duì)提取的lncRNA進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：該胃液中l(wèi)ncRNA的提取方法，包括如下步驟：

(1)采用RNA抽提試劑提取人胃液總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)RNA提取液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA；

(2)對(duì)步驟(1)的cDNA溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再用熒光定量PCR儀檢測(cè)擴(kuò)增；

其特征在于：步驟(1)中采用抽提劑Trizol?LS對(duì)胃液進(jìn)行RNA的提取，并且在步驟(2)中通過lncRNA特異性擴(kuò)增上下游引物或GAPDH擴(kuò)增上下游引物對(duì)cDNA溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

其中，所述步驟(1)的具體步驟為：

a、胃液抽取：用胃管抽取空腹人胃液3～6ml，放入離心管中，室溫下3000rpm離心3分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一無RNA酶離心管中，至于冰上；

b、胃液預(yù)處理：取步驟a的胃液250～350μl置于2ml無RNA酶離心管中，加入3倍體積的Trizol?LS試劑，漩渦振蕩10秒，室溫靜置5分鐘，4℃下，12000rpm離心10分鐘，將上層液體轉(zhuǎn)移到一新的無RNA酶離心管中；

c、三氯甲烷提取：在步驟b的上清液中加入0.2～0.3ml三氯甲烷，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘，4℃下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入新的無RNA酶離心管中；