[發明專利]一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法

有效

• 申請號: 201410088376.2
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103834738A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 郭俊明;邵永富;肖丙秀
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 徐雪波

1.一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，包括如下步驟：

(1)采用RNA抽提試劑提取人胃液總RNA，用逆轉錄試劑對RNA提取液進行逆轉錄反應得到cDNA；

(2)對步驟(1)的cDNA溶液進行PCR擴增反應，再用熒光定量PCR儀檢測擴增；

其特征在于：步驟(1)中采用抽提劑Trizol?LS對胃液進行RNA的提取，并且在步驟(2)中通過lncRNA特異性擴增上下游引物或GAPDH擴增上下游引物對cDNA溶液進行PCR擴增反應。

2.如權利要求1所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)的具體步驟為：

a、胃液抽取：用胃管抽取空腹人胃液3～6ml，放入離心管中，室溫下3000rpm離心3分鐘，將上清轉移到另一無RNA酶離心管中，至于冰上；

b、胃液預處理：取步驟a的胃液250～350μl置于2ml無RNA酶離心管中，加入3倍體積的Trizol?LS試劑，漩渦振蕩10秒，室溫靜置5分鐘，4℃下，12000rpm離心10分鐘，將上層液體轉移到一新的無RNA酶離心管中；

c、三氯甲烷提取：在步驟b的上清液中加入0.2～0.3ml三氯甲烷，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘，4℃下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入新的無RNA酶離心管中；

d、異丙醇沉淀：加入與步驟c中上層水相等體積的異丙醇，混勻后，4℃條件下靜置20分鐘，然后4℃下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉淀；

e、乙醇洗滌：在步驟d的沉淀中加入質量分數為75%的乙醇1ml，顛倒數次，4℃下12000rpm離心5分鐘，棄上清；

f、干燥RNA：上一步棄上清后，再次4℃下12000rpm離心2分鐘；棄上清，室溫下干燥1～2分鐘，加10μl無RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存備用；

g、RNA逆轉錄：用逆轉錄試劑對步驟f的RNA提取液進行逆轉錄反應得到cDNA溶液，置-20℃保存備用；

h、PCR檢測：對步驟g的cDNA溶液進行PCR擴增反應，擴增上下游引物為lncRNA特異性擴增上下游引物或GAPDH擴增上下游引物，再用熒光定量PCR儀檢測。

3.如權利要求1所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中lncRNA特異性擴增上下游引物分別為RMRP擴增上下游引物。

4.如權利要求1所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中lncRNA特異性擴增上下游引物分別為AA174084擴增上下游引物。

5.如權利要求1所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中GAPDH特異性擴增上游引物為：5’ACCCACTCCTCCACCTTTGAC3’；和GAPDH特異性擴增下游引物為：5’TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT3’。

6.如權利要求3所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述RMRP擴增上游引物為：5’ACTCCAAAGTCCGCCAAGA3’；和RMRP擴增下游引物為：5’TGCGTAACTAGAGGGAGCTGAC3’。

7.如權利要求4所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述AA174084擴增上游引物為：5’CTGGTTCTTCATCCCTGCTATG3’；和AA174084擴增下游引物為：5’CCTGCTCCTCTTTGTGTTCTCT3’。

8.如權利要求1所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)的PCR擴增反應條件為：95℃預變性5分鐘；然后94℃變性15秒，55℃退火30秒，70℃延伸30秒，共45個循環。

9.如權利要求1所述的一種胃液中lncRNA的提取與檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)中胃液與抽提劑Trizol?LS的加入比例為1：2.5～3.5。