[發(fā)明專利]一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測試紙條

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410088234.6
• 申請日: 2014-03-12
• 公開（公告）號: CN103808945A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 成子強;王言明
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及了一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測試紙條。

背景技術(shù)

J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一種腫瘤性疾病，臨床上主要以髓細(xì)胞性白血病多見，研究發(fā)現(xiàn)J亞群禽白血病毒還能誘發(fā)淋巴細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病等多種腫瘤性疾病。J亞群禽白血病已經(jīng)從最初的感染肉雞到現(xiàn)在的感染蛋雞、火雞及地方雞品種。近幾年，禽白血病的流行呈現(xiàn)高感染率、高發(fā)病率，早期感染普遍、發(fā)病日齡明顯提前，混合感染促使病毒重組頻率增高，宿主范圍擴展、腫瘤趨于多樣化等新特點。目前，與J亞群白血病密切相關(guān)的血管瘤病在蛋種雞群及商品蛋雞群中的爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。基于其病毒特性，一直未有行之有效的疫苗、藥物防治此病。國外通過凈化控制本病的發(fā)生。由于凈化周期長、成本高，在我國目前還未能有效實施，只能通過淘汰感染雞只進(jìn)行大群凈化，快速精準(zhǔn)檢測J亞群禽白血病的感染對于凈化控制J亞群禽白血病具有極其重要的意義。

（1）ALV-J表面蛋白（SU）的生物學(xué)功能

ALV-J屬于反轉(zhuǎn)錄病毒。病毒囊膜蛋白可分為由gp85基因編碼的表面蛋白（surface?protein,SU）和gp37基因編碼的跨膜蛋白（transm-embrane?protein，TM），二者在一起形成二聚體，病毒囊膜蛋白決定亞群的特異性。SU含有病毒---受體決定簇，負(fù)責(zé)識別靶細(xì)胞膜上的特異性受體，TM負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合過程。SU刺激機體產(chǎn)生的中和抗體具有亞群特異性。ALV-J表面蛋白的核酸序列與其它ALV亞群同源性只有40%。ALV-J囊膜蛋白的SU可特異性識別J亞群禽白血病毒刺激機體產(chǎn)生的中和抗體，對于J亞群禽白血病的診斷具有重要意義。

（2）J亞群禽白血病診斷方法研究現(xiàn)狀

對于J亞群禽白血病的診斷方法國內(nèi)外都有過許多報道，主要為病毒分離與鑒定、免疫學(xué)檢測方法、核酸分子檢測方法。病毒的分離與鑒定耗費時間過長且只適用于實驗室診斷；免疫學(xué)檢測方法如間接免疫熒光、ELISA方法等都需要一定的專業(yè)知識和設(shè)備，不適用于養(yǎng)殖場的現(xiàn)場檢測；核酸分子檢測方法如PCR等容易受到假陽性、假陰性及抗原變異的干擾，且上述檢測方法均建立在實驗室基礎(chǔ)上并需要專業(yè)操作人員操作。因此研制快速精準(zhǔn)并易于操作攜帶的J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測試紙條，對于我國雞群J亞型禽白血病的凈化防制具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種J亞群禽白血病免疫膠體金抗體檢測試紙條，其中最主要的是采用了原核表達(dá)后純化的J亞群禽白血病病毒表面蛋白偶聯(lián)免疫膠體金，利用該膠體金可以快速檢測血清中的J亞群禽白血病抗體，進(jìn)而為雞群J亞群禽白血病精準(zhǔn)快速診斷提供技術(shù)保障。通過Western?Blot檢測表達(dá)的gp85蛋白能夠與JE9單抗和抗HIS標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明具有良好的特異性。

本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案是：

通過比對臨床病例，特別是混合腫瘤、單純髓細(xì)胞瘤、血管瘤、纖維肉瘤、組織肉瘤、成紅細(xì)胞瘤、腎瘤等病例，通過抗體及PCR檢測確定ALV-J感染，DF-1細(xì)胞培養(yǎng)并分離病毒，比對分析各病毒表面蛋白的關(guān)鍵保守基因序列，最終確定采用ALV-J?gp85基因片段，并根據(jù)上述表面蛋白的關(guān)鍵保守基因序列設(shè)計引物擴增保守序列，最終原核表達(dá)的SU蛋白制備試紙條，所獲得的試紙條可以完全實現(xiàn)J亞群禽白血病的精準(zhǔn)診斷。

其具體過程如下：

根據(jù)現(xiàn)有的ALV-J設(shè)計特異性引物，所述的正向引物為5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamHⅠ酶切位點，其基因序列如SEQ?ID?NO.2所示；反向引物為5’-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’,含Hind?III酶切位點，其基因序列如SEQ?ID?NO.3所示。

利用上述一對引物以J亞群禽白血病病毒的DNA為模版進(jìn)行PCR擴增，其中優(yōu)選采用NXO1O1(ALV-J,DQ115805.1)的DNA為模板；

PCR反應(yīng)條件為：95℃5min，充分變性后進(jìn)入循環(huán)體系：95℃40s，65℃1min，72℃1min，循環(huán)35次后72℃延伸10min。

擴增產(chǎn)物測序，其基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；