[發明專利]一種利用24孔板篩選潤滑油降解菌的方法

無效

• 申請號: 201410085920.8
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103820522A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 姜巖;張賢明;楊穎
• 申請（專利權）人: 重慶工商大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種功能型微生物的篩選方法，適合于微生物在油水兩相反應體系中的功能特性表征，特別適用于大規模的菌種篩選，在環境微生物生物降解研究方面可以廣泛應用。

背景技術

鑒于全球能源匱乏，以石油為原料加工而成的潤滑油在生產加工、儲運、使用過程中不可避免地會污染水土環境。在我國，潤滑油消耗量已達到世界第二，且消耗量在逐年攀升。不同于燃油，潤滑油在使用過程中因受到理化等因素的影響將導致品質下降，無法繼續使用，而形成廢油。受到能源需求緊張和嚴格的環保限制必須對廢潤滑油進行回收處理。在這部分廢舊潤滑油中，有近半數無法回收利用，由于包括廢油處理企業在內的廢潤滑油產生單位缺乏有效的末端治理環節，而將其大量排入環境中，造成嚴重的環境污染和生態破壞。因此，利用生物降解技術進行潤滑油污染的生物治理對于廢油處理行業以及生態環境的可持續發展具有重要意義。

近年來，利用種群、功能多樣化的微生物，針對廢潤滑油及其組分開展生物降解研究的報道越來越多。在這些研究中，高活力菌種資源的獲取成為各類相關研究的物質基礎。鑒于對于潤滑油及其組分含量的檢測手段較為繁瑣，在大規模菌種篩選中工作量大，甚至難以在平行條件下進行菌種降解能力的評價。對此，本發明開發出一種利用24孔板篩選高活力潤滑油降解菌種的方法。這種方法的理論基礎建立在如下兩個方面：其一，建立在油和水可以形成油水兩相，且界面膜較為清晰，可以依賴于油膜在菌種作用下的消退情況來評價菌種對潤滑油的降解能力；其二，依賴于潤滑油被生物降解時生物量增加，同時，24孔板的每個參與實驗的孔內，可以提供至少2mL以上的細胞發酵液，滿足分光光度法檢測對液體量的要求，因此，可以利用細胞光密度檢測來作為另一判斷依據。上述兩個評價指標具有操作簡單便捷、快速的優點，極大地減少了菌種大規模篩選的工作量，綜合評價二者可以較為準確地評價菌種的潤滑油生物降解特性。??

發明內容

本發明涉及一種利用24孔板篩選潤滑油降解菌種的方法。在油水兩相體系中，潤滑油在無機鹽選擇性培養基表面形成油膜，油水界面層清晰可見，生物降解作用則主要發生在油水兩相間，實驗表明，細胞利用潤滑油的結果可以使油膜顏色從中間開始逐漸由黃色或近黑色變成乳白色，反之，若油膜未發生改變則認為該菌種不能較好地利用潤滑油，即為非目的菌株。該方法的最大優點是操作簡單，大幅度地減少了工作負荷。

實現本發明的進一步描寫：

在5-7天的生物降解周期內，潤滑油不斷被利用，油膜逐漸消退，中心乳白色區域逐漸向邊緣擴散，直至整個微孔內除邊緣隱約可見潤滑油外其它部分顏色完全消失，以此來作為菌種降解潤滑油的評價依據之一。對于降解能力較弱但可以利用潤滑油的菌種，在此體系以及生物降解周期內，油膜顏色不消退或僅在中央部分消退，則初步判定該菌種不具備優良的潤滑油降解能力。不過，實驗過程中發現，該方法可能存在一定實驗誤差，為此，實驗過程中可以平行設置3個以上平行樣品參與實驗，這樣的實驗設計不會產生過大的工作負荷。在進行降解能力評價時，對于降解能力良好者以“-?-”表示，降解能力一般者以“-”表示，降解效果不好，油膜基本不消退者以“+”表示，最終的菌種篩選結果則可以根據大規模菌種篩選的總體實驗結果進行確定。比如，在某次大規模菌種篩選中，幾株菌在降解實驗中表現出3個“-?-”，則可以考慮將降解效果低于2個“-?-”和1個“-”的菌種淘汰；而若出現的3個“-?-”實驗結果的菌種數量少，不能滿足工作需要，甚至未出現最佳的實驗結果，則可以保留2個“-?-”和1個“-”的菌種。總之，菌種的最終篩選結果可以根據實驗工作需要靈活判定。

在此實驗體系中，另外一個評價菌種降解能力的依據是細胞光密度值。實驗表明，在多數情況下，細胞光密度OD₆₀₀值的變化趨勢與油膜的變化趨勢一致，即油膜消退意味著生物降解作用的發生，說明菌種具有潤滑油降解能力，更多的底物被消耗且其中部分用以合成新細胞，而且，隨著油膜的逐漸消退，OD₆₀₀值逐漸增加。不過，反復的實驗驗證發現，少部分實驗中油膜的消退存在著實驗誤差，反饋在OD₆₀₀值上，沒有表現出增加的趨勢，而且這種現象總是發生在油膜消退實驗平行性不好的樣本中，此時，應考慮淘汰菌種，或根據實際情況重復實驗進行驗證，亦可采用定量化檢測方法予以驗證。