[發(fā)明專利]一種真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物及其發(fā)酵制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410085685.4
• 申請(qǐng)日: 2012-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103834695A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖亞中;方澤民;劉娟娟;洪宇植;房偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/42
• 分類號(hào): C12P7/42;C12N9/02;C07C59/245;C07C51/42;C12R1/645
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 何梅生;王偉

本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年5月7日，申請(qǐng)?zhí)枮?012101384476，發(fā)明名稱為“一種真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物及其發(fā)酵制備方法與應(yīng)用”的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化合物分離純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物來(lái)源的真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物的發(fā)酵制備、高純度漆酶誘導(dǎo)活性化合物的純化工藝及其在真菌漆酶誘導(dǎo)方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

漆酶（Laccase,EC1.10.3.2）是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物氧化，同時(shí)伴隨有分子氧還原成水。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿和漂白、食品風(fēng)味改良、飼料營(yíng)養(yǎng)改善、人工合成染料脫色、紡織纖維軟化細(xì)化、新型藥物開(kāi)發(fā)、生物傳感器制造及新型能源開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有潛在重要應(yīng)用價(jià)值（Arora?DS,Sharma?RK(2010)Ligninolytic?fungal?laccases?and?their?biotechnological?applications.Appl?Biochem?Biotechnol?160:1760–1788），近年來(lái)成為國(guó)際酶工程學(xué)和環(huán)境科學(xué)交叉領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

漆酶廣泛存在于高等真菌（特別是擔(dān)子菌）中。多數(shù)真菌分泌的天然漆酶存在產(chǎn)量低、發(fā)酵周期長(zhǎng)、后處理繁瑣等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足工業(yè)化應(yīng)用的需要。目前，用來(lái)提高漆酶的生物合成產(chǎn)量主要有兩種方法：重組表達(dá)和添加化合物誘導(dǎo)。然而，重組表達(dá)產(chǎn)量依然較低、且生產(chǎn)成本高、后處理難度大，使漆酶生產(chǎn)的成本大大提高，限制了漆酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用；有效的誘導(dǎo)劑多為芳香類化合物或重金屬離子，其有環(huán)境毒性并且價(jià)格昂貴，有效作用濃度大，通常在10^-3～10^-2摩爾級(jí)別，易造成環(huán)境污染，生產(chǎn)后的發(fā)酵液需要脫毒處理，提高了生產(chǎn)成本，同樣無(wú)法突破漆酶產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。因此，尋找一種清潔、高效的漆酶生產(chǎn)方式是推進(jìn)漆酶產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種高效真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物（名稱為3-羥基-2-辛基-戊二酸）的發(fā)酵制備和分離純化工藝及其在真菌漆酶誘導(dǎo)發(fā)酵方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之一是提供一種對(duì)真菌漆酶具有高誘導(dǎo)活性的化合物，該化合物有如下分子式：

本發(fā)明的的另一目的是保護(hù)該活性化合物在誘導(dǎo)真菌漆酶合成方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的活性的化合物來(lái)源于微生物發(fā)酵菌株Gongronella?sp，該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢市武昌區(qū)八一路武漢大學(xué)；保藏日期：2012年3月27日；保藏號(hào)為：CCTCCAF2012004。

該活性化合物的發(fā)酵制備方法，是將上述發(fā)酵菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，然后再發(fā)酵液經(jīng)分離純化后獲得純活性化合物。

所述發(fā)酵培養(yǎng)是指將Gongronella?sp.接種在經(jīng)滅菌的pH4.0～7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度25～31℃、搖床轉(zhuǎn)速100～150rpm條件下培養(yǎng)3～7天后通過(guò)紗布過(guò)濾收集發(fā)酵液備用；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升水中含10～20g蔗糖、1～2g?DL-天冬酰胺、0.7～1.5g?KH₂PO₄、0.2～0.6gMgSO₄·7H₂O、0.02～0.15g?Na₂PO₄·7H₂O、0.01～0.05g?CaCl₂、0.01～0.05g?FeSO₄·7H₂O、0.01～0.04g腺嘌呤、20～60μg?VB₁。

作為優(yōu)先，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升水中含15g蔗糖、1.5g?DL-天冬酰胺、1g?KH₂PO₄、0.5g?MgSO₄·7H₂O、0.1g?Na₂PO₄·7H₂O、0.01g?CaCl₂、0.01g?FeSO₄·7H₂O、0.0275g腺嘌呤、50μg?VB₁。

所述分離純化依次包括以下步驟：