[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌shou003、抗弧菌蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410084416.6
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN103834596B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發(fā)明（設計）人: 張慶華;郭婧;王娟;封永輝;宋增福;陳彪;張永華
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P1/00;C12P21/02;C07K14/32;C07K1/34;C12R1/125
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌shou003、抗弧菌蛋白及其制備方法與應用。

背景技術(shù)

弧菌病（Vibriosis）是由弧菌屬（Vibrio）細菌引起的，在世界各地養(yǎng)殖魚、蝦、蟹及貝類等水產(chǎn)動物中普遍流行且危害最大的細菌性疾病，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失不可估量。

目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)用來控制弧菌病的主要手段是抗生素防治，因為抗生素使用起來方便，便于操作，而且其見效比較快，療效也比較好。然而由于抗生素等化學藥物的長期應用及濫用，導致許多細菌已對其逐漸產(chǎn)生耐藥性，從而增加了病害的防治難度，且有些藥物殘留嚴重，嚴重危害到人類的健康。

因此人們積極探索使用中草藥、免疫制劑、益生菌等新措施防治病害，其中，益生菌作為一種生物防治方法，不僅能夠有效的控制病原菌的數(shù)量，減少疾病的發(fā)生，增強養(yǎng)殖動物的免疫力，而且還能改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，維護微生態(tài)平衡，具有廣闊的應用前景。篩選抗菌效果良好的益生菌，對于生物防治弧菌病至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌shou003，旨在解決現(xiàn)有抗生素防治弧菌病導致的細菌產(chǎn)生耐藥性、防治難度增大且會危害人類健康等問題。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述枯草芽孢桿菌shou003發(fā)酵培養(yǎng)的方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述枯草芽孢桿菌shou003的應用。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種通過上述枯草芽孢桿菌shou003發(fā)酵得到的抗弧菌蛋白，該蛋白對病原弧菌具有良好的抑制作用。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述抗弧菌蛋白的制備方法。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）shou003，于2013年11月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2013571。

本發(fā)明進一步提供了上述枯草芽孢桿菌shou003發(fā)酵培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：

（1）取所述枯草芽孢桿菌shou003菌種接種到活化培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18～20h后，在8000rpm/min條件下離心5min，取沉淀用無菌水洗滌并配成濃度為10⁷CFU/ml菌液；

（2）將所述菌液按發(fā)酵培養(yǎng)基1%體積的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在4～40℃、pH為4～7條件下?lián)u床培養(yǎng)10～16h，得到枯草芽孢桿菌shou003發(fā)酵液。

優(yōu)選地，在步驟（1）中，所述活化培養(yǎng)基包括以下按質(zhì)量份計各組分：

蛋白胨9～10份，

牛肉浸出粉2～3份，

氯化鈉4～5份；

在步驟（2）中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH為5，且所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下按質(zhì)量份計各組分：

麥芽糖1～2份，

牛肉膏1～2份，

C_aCl₂0.2～0.3份。

優(yōu)選地，在步驟（1）中，所述活化培養(yǎng)基包括以下按質(zhì)量份計各組分：

蛋白胨10份，

牛肉浸出粉3份，

氯化鈉5份；

在步驟（2）中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下按質(zhì)量份計各組分：

麥芽糖2份，

牛肉膏2份，

C_aCl₂0.3份。

本發(fā)明進一步提供了上述枯草芽孢桿菌shou003在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用。

優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌shou003用于抑制水產(chǎn)病原菌。

優(yōu)選地，所述水產(chǎn)病原菌包括副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）、遲緩愛德華菌（Edwardsiellatarda）。

本發(fā)明進一步提供了一種抗弧菌蛋白，通過對上述枯草芽孢桿菌shou003的胞外產(chǎn)物進行濃縮提取得到，該抗弧菌蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

本發(fā)明進一步提供了上述抗弧菌蛋白的制備方法，包括以下步驟：

（1）將權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌shou003在營養(yǎng)瓊脂斜面上活化后接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～20h，在9600rpm/min、4℃條件下離心20min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得到過濾液體；