[發明專利]一種枯草芽孢桿菌shou003、抗弧菌蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410084416.6
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN103834596B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 張慶華;郭婧;王娟;封永輝;宋增福;陳彪;張永華
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P1/00;C12P21/02;C07K14/32;C07K1/34;C12R1/125
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）shou003，于2013年11月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2013571。

2.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌shou003發酵培養的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）取所述枯草芽孢桿菌shou003菌種接種到活化培養基中，37℃搖床培養18～20h后，在8000rpm/min條件下離心5min，取沉淀用無菌水洗滌并配成濃度為10⁷CFU/ml菌液；

（2）將所述菌液按發酵培養基1%體積的接種量接種至發酵培養基中，在4～40℃、pH為4～7條件下搖床培養10～16h，得到枯草芽孢桿菌shou003發酵液。

3.如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌shou003發酵培養的方法，其特征在于，在步驟（1）中，所述活化培養基包括以下按質量份計各組分：

蛋白胨9～10份，

牛肉浸出粉2～3份，

氯化鈉4～5份；

在步驟（2）中，所述發酵培養基pH為5，且所述發酵培養基包括以下按質量份計各組分：

麥芽糖1～2份，

牛肉膏1～2份，

C_aCl₂0.2～0.3份。

4.如權利要求3所述的枯草芽孢桿菌shou003發酵培養的方法，其特征在于，在步驟（1）中，所述活化培養基包括以下按質量份計各組分：

蛋白胨10份，

牛肉浸出粉3份，

氯化鈉5份；

在步驟（2）中，所述發酵培養基包括以下按質量份計各組分：

麥芽糖2份，

牛肉膏2份，

C_aCl₂0.3份。

5.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌shou003在水產養殖中的應用。

6.如權利要求4所述的枯草芽孢桿菌shou003在水產養殖中的應用，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌shou003用于抑制水產病原菌。

7.如權利要求5所述的枯草芽孢桿菌shou003在水產養殖中的應用，其特征在于，所述水產病原菌包括副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）、遲緩愛德華菌（Edwardsiellatarda）。

8.一種抗弧菌蛋白，其特征在于，通過對權利要求1所述的枯草芽孢桿菌shou003的胞外產物進行濃縮提取得到，該抗弧菌蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

9.權利要求6所述的抗弧菌蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）將權利要求1所述的枯草芽孢桿菌shou003在營養瓊脂斜面上活化后接種于營養肉湯培養基，28℃恒溫振蕩培養18～20h，在9600rpm/min、4℃條件下離心20min，取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾，得到過濾液體；

（2）用硫酸銨沉淀法對所述過濾液體提取，獲得抗弧菌蛋白提取液。

10.如權利要求9所述的抗弧菌蛋白的制備方法，其特征在于，所述硫酸銨沉淀法包括以下步驟：取芽孢桿菌過濾液50ml，加入固體硫酸銨使溶液達到質量百分比濃度70%，4℃下過夜，于8000rpm/min離心20min后得沉淀物，沉淀用0.05MTris-HCl緩沖液溶解，透析48h后取袋內物質，即為該濃度硫酸銨沉淀所獲得的蛋白。