[發明專利]一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201410084204.8
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN104911276A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發明（設計）人: 趙家平;徐超;李光玉;杜銳;張秀麗;宋興超;劉晗璐;朱洪偉;陳秀敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及動物疾病檢測診斷方法技術領域，特別是涉及一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，非常適合在現場對水貂阿留申病毒進行定性及定量檢測，對于飼養場早期檢測診斷、流行病學疫情調查及進出口岸檢測具有重要作用。

背景技術

自20世紀50年代發現水貂阿留申病（ADM）以來，由于ADM致病機理比較特殊，所以至今尚未研制出有效預防該病的常規疫苗，生產上主要以預防為主，目前主要通過檢測阿留申病毒（AMDV）發現陽性者淘汰凈群控制ADM。所以建立一種有效的診斷方法對ADM的防治有重要意義，傳統的AMDV檢測方法包括：病原的分離和生物學實驗、電鏡技術等病原學診斷方法，碘凝集試驗(IAT?)?和對流免疫電泳(CIEP)?、補體結合試驗、免疫復合物檢測法(CIC)?等血清學檢測方法；基因芯片技術、聚合酶鏈式反應(PCR)?、核酸雜交技術等分子生物學診斷方法。這些方法普遍存在如周期長、操作繁瑣、特異性、敏感性和重復性差等缺點，不適合大批量自動化檢測，給ADM的防控帶來一定困難。

熒光定量PCR由于采用了完全閉管檢測，不需凝膠電泳等PCR后處理，避免了交叉污染，整個檢測過程可實現自動化，且反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰、勞動強度小，易于批量化、標準化應用。隨著熒光定量PCR儀和相應耗材價格的降低，尤其是小型實時熒光定量PCR和配套自動化操作設備的出現，極大地降低了熒光定量PCR的成本，簡化了定量檢測的過程，提高了工作效率。可以預見不久將來，隨著熒光定量PCR相關成本進一步下降和可攜帶全自動熒光定量PCR儀出現，采用該技術對AMDV進行現場檢測將成為控制ADM的一種有效方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，用于對AMDV的檢測。

為了實現快速檢測AMDV，本發明是通過以下技術方案實現的：

一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ?ID?N0.1?5'-?CCCTCCAGGTCAACTCTTTGTTAAA-3'和下游引物序列為SEQ?ID?N0.2?5'-GCCTCTCCAAGTAAAGTAACCATAGG-3'。

一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，該試劑盒包括1）含有上述的上游引物和下游引物以及SYBR?Green染料的PCR?Master?mix，上、下游引物終濃度均為0.25μmol/L；2）病毒裂解液；3）陰性對照-無菌超純水；4）陽性對照-?10²copies/μL連有病毒部分序列amdv-f1的pMD19-T-amdv-f1質粒，amdv-f1序列如SEQ?ID?N0.3所示；5）異丙醇；6）75%乙醇。

pMD19-T-amdv-f1陽性質粒制備方法如下：利用上游引物SEQ?ID?N0.1?和下游引物SEQ?ID?N0.2以水貂AMDV-G株為模板，在EasyCycler基因擴增儀（Analytikjena）進行。反應體系為20?μL，包括:?10μL?Premix?Taq，8μL?ddH2O,1μL?模板，上下游引物（各5μmol/L）混合物1μL。擴增參數為:94℃預變性10s；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環；72℃后延伸7?min。

反應產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒對PCR產物純化回收，將回收的PCR產物用pMD19-T?Vector進行連接，在0.2?mL的PCR管中，取PCR回收產物?4?μL和pMD19-T?Vector?1?μL，加5?μL連接緩沖液，16?℃過夜連接。連接液全量（10?μL）加入至?100?μL冰中溶解Trans5α感受態細胞中，冰中放置?30?min。42℃加熱?45?s后，再在冰中放置?1?min。加入890μL?SOC?培養基，37℃振蕩培養60min。在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。挑選白色菌落，使用?PCR?法確認載體中插入片段的長度大小。從平板上挑取4個克隆接種于5?mL?100?μg/mL?氨芐的LB培養基中，37?℃培養14h。取4mL過夜培養菌液，用質粒提取試劑盒抽提質粒，送質粒測序。將測序結果正確的質粒命名為pMD19-T-amdv-f1并在BioPhotometer（eppendorf）上測定濃度，根據重組質粒提取物濃度計算拷貝數。