[發明專利]一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201410084204.8
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN104911276A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發明（設計）人: 趙家平;徐超;李光玉;杜銳;張秀麗;宋興超;劉晗璐;朱洪偉;陳秀敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，其特征在于，其引物核苷酸序列為:?上游引物序列為SEQ?ID?N0.1?5'-?CCCTCCAGGTCAACTCTTTGTTAAA-3'和下游引物序列為SEQ?ID?N0.2?5'-GCCTCTCCAAGTAAAGTAACCATAGG-3'。

2.含有權利要求1所述快速檢測水貂阿留申病毒擴增引物的試劑盒。

3.一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，該試劑盒包括：陽性對照:?1×10²?copies/μL含有阿留申病毒部分序列的pMD19-T-amdv-f1質粒（amdv-f1質粒序列如SEQ?ID?N0.3所示）分裝為25μL/管，-20℃保存；陰性對照和溶解DNA用水：超純水高壓滅菌后，分裝為2.5mL/管，-20℃保存；病毒裂解液：含3mol/L異硫氰酸胍、0.4%十二烷基肌氨酸鈉、0.12?mmol/L?β-巰基乙醇、20mmol/L檸檬酸鈉的病毒裂解液，40mL/瓶分裝，-4℃保存；異丙醇：60?mL/瓶分裝，常溫保存；75%乙醇：超純水高壓滅菌后配制75%乙醇，120mL/瓶分裝，常溫保存；PCR?Master?mix：取商品化2×SYBR?Green?PCR?Master?mix、無菌超純水、5μmol/L上下游引物混合物按10:7:1比例混合，18μL/管分裝于8連管或96孔板中，-20℃避光保存。

4.一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，該試劑盒包括：陽性對照、陰性對照和溶解DNA用水各1管，病毒裂解液、異丙醇、75%乙醇各1瓶，1.5mL離心管96個，含18μL/管PCR?Master?mix?8聯PCR反應管12組或含18μL/管PCR?Master?mix?96孔板1塊。

5.一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，該方法包括以下步驟：（1）待檢樣本的DNA提?。?.5mL塑料離心管中加入200μL待測液體樣品，加入400μL病毒裂解液，振蕩40s后室溫放置10min，振蕩30s混勻后加入600μL異丙醇，振蕩45s混勻后，15000?g室溫離心16min；棄上清，加入1.2mL?75%?乙醇，振蕩15s后15000?g室溫離心5min，棄上清，離心15s棄殘留上清，開蓋靜置30s，加20μL超純水，振蕩溶解待用；(2)熒光PCR檢測：取上述溶液2μL同時各取陰陽性對照2μL加入含18μL/管PCR?Master?mix?8聯PCR反應管或含18μL/管PCR?Master?mix?96孔板中混勻后在熒光定量PCR儀上進行擴增。

6.擴增程序如下：95?℃預變性10?min；95?℃變性15?s、60?℃退火60?s，40個循環；(3)結果判定：反應液測定Ct值均大于35或無數值的標本為陰性；FAM通道測定?Ct≤30的標本為陽性標本；測定30?<?Ct?<?35的標本復測，復測結果Ct?<?35為陽性，復測結果Ct?>35的為陰性。