[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉和大腸埃希氏菌二聯(lián)疫苗

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410082925.5
• 申請日: 2014-03-07
• 公開（公告）號: CN103861098A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉蕾;郭玉廣;申洪銀;陶曉珊;鄒桂榮;鄒敏;胡瀟;范根成;孫健
• 申請（專利權(quán)）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/39;A61P1/12;A61P31/14;A61P31/04
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬流行性腹瀉和大腸埃希氏菌二聯(lián)疫苗。

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉(Porcine?epidemic?diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，本病對不同年齡的豬均易感，尤其哺乳仔豬危害最嚴(yán)重，是一種高度接觸性傳染病。該病于1971年首發(fā)于英國，20世紀(jì)80年代初我國陸續(xù)發(fā)生本病。近幾年，全國豬流行性腹瀉呈爆發(fā)流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病感染目前還沒有有效的治療方法，主要是以疫苗免疫預(yù)防為主。目前，國外主要是韓國的弱毒苗，國內(nèi)主要是哈獸研研制的豬傳染性胃腸炎等疫苗，但臨床應(yīng)用效果不佳。

另外，仔豬黃痢是由特定O抗原型的致病性大腸埃希氏菌（E.coli）引起的初生仔豬的以下痢為特征的傳染病。該病主要導(dǎo)致1周齡內(nèi)（主要是1～3日齡）仔豬發(fā)病，以排出黃色水樣糞便和漸進(jìn)性死亡為特征，是影響規(guī)模化種豬場和農(nóng)村散養(yǎng)豬仔豬成活率的重要疾病。但目前市場上并沒有有效的預(yù)防豬流行性腹瀉和仔豬黃痢的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種豬流行性腹瀉和大腸埃希氏菌二聯(lián)疫苗，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的豬流行性腹瀉和大腸埃希氏菌二聯(lián)疫苗，包含有抗原和疫苗佐劑，其中抗原是保藏編號為CGMCC?No.8503的豬流行性腹瀉病毒和大腸埃希氏菌K88、K99、987P的纖毛抗原。

所述的疫苗佐劑為氫氧化鋁膠佐劑。

上述的二聯(lián)疫苗中豬流行性腹瀉病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml，K88纖毛抗原含量≥100個(gè)抗原單位/ml、K99纖毛抗原含量≥50個(gè)抗原單位/ml、987P纖毛抗原含量≥50個(gè)抗原單位/ml。

本發(fā)明的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）制備Vero細(xì)胞，生長液為含8%新生牛血清的MEM，當(dāng)細(xì)胞長成單層后接種豬流行性腹瀉病毒；

（2）取豬流行性腹瀉病毒SD10株按1%接種量接種到Vero細(xì)胞單層，置37℃吸附1.5小時(shí)，加含2%新生牛血清MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)；

（3）接毒后，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)收獲病毒液，反復(fù)凍融3次；

（4）取凍融后的病毒液測定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

（5）將檢驗(yàn)合格的細(xì)胞毒液置于滅菌容器內(nèi)，加入10%福爾馬林溶液至終濃度為0.2%，37℃滅活18小時(shí)；

（6）按發(fā)酵罐容積70%（V/V）加入Minca液體培養(yǎng)基，同時(shí)按培養(yǎng)基0.1%（V/V）加入消泡劑，通入高溫蒸汽滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基溫度降至35～37℃，按3%（V/V）向發(fā)酵罐中加入種子培養(yǎng)物，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37℃，調(diào)節(jié)融氧濃度至35%，培養(yǎng)5～7小時(shí)分別制備含K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌C83710菌株的菌液；

（7）各菌株發(fā)酵培養(yǎng)菌液經(jīng)管式離心機(jī)10000r/min離心30分鐘，收獲的菌泥按0.1g/ml比例重新懸浮于生理鹽水中。采用剪切機(jī)對在58～65℃對含不同纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按5000～6000r/min的剪切強(qiáng)度剪切20～25分鐘分別進(jìn)行各纖毛抗原的提取；

（8）按每1ml成品苗中，K88纖毛抗原含量≥100個(gè)抗原單位、K99纖毛抗原含量≥50個(gè)抗原單位、987P纖毛抗原含量≥50個(gè)抗原單位，配制混合纖毛液；

（9）將（5）中的病毒溶液和（8）中的混合纖毛液例混合后，與疫苗佐劑混合制備成疫苗。

本發(fā)明的豬流行性腹瀉、大腸埃希氏菌二聯(lián)滅活疫苗免疫原性好，免疫后抗體產(chǎn)生快，產(chǎn)生的抗體滴度高且維持時(shí)間長，保存期長，免疫劑量小，選用的佐劑易于注射，可一針防治兩種疾病，在配種前進(jìn)行免疫注射可使懷孕母豬所產(chǎn)仔豬獲得較好的被動免疫，使仔豬產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，能夠抵抗強(qiáng)毒的攻擊，提高仔豬的存活率。

具體實(shí)施方式