[發(fā)明專利]一種水溶性抗生素的分離純化制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410082586.0
• 申請(qǐng)日: 2014-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN103805645A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝再彬;李霞;嚴(yán)麗;張杰;宋福平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 桂林理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P13/00
• 分類號(hào): C12P13/00;C07K1/20;C07K1/14;C07K1/16;C12R1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種水溶性抗生素的分離純化制備方法，該方法制備的水溶性抗生素含有364和382兩種分子量的分子結(jié)構(gòu)。

背景技術(shù)

1994年Manker發(fā)現(xiàn)蠟狀芽胞桿菌(Bacillus?cereus，Bc)編號(hào)UW85的菌株能夠生物合成抗生素，該抗生素水溶性極強(qiáng)，分子量為396，分子構(gòu)成C₁₃H₂₈N₆O₈，分子結(jié)構(gòu)如下：

；

上述抗生素分子具有線性氨基多元醇結(jié)構(gòu)，該抗生素的英文名稱為Zwittermicin?A(簡寫ZwA)，即雙效菌素。該抗生素對(duì)卵菌、藻類、原生生物和多種細(xì)菌及部分植物病原真菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，具有廣譜抗菌性。

目前蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis，Bt)是生產(chǎn)規(guī)模最大、應(yīng)用最為成功的微生物殺蟲劑，特有的殺蟲晶體蛋白是天然殺蟲劑，是最有利用前景的無公害生物農(nóng)藥。殺蟲晶體蛋白的基因片段在轉(zhuǎn)基因植物中廣為利用，如抗蟲棉等。雖然Bt有諸多優(yōu)點(diǎn)，但它在田間應(yīng)用時(shí)也存在防治效果不穩(wěn)定、殘效期短、殺蟲速度慢、對(duì)某些目標(biāo)害蟲不敏感、容易使害蟲產(chǎn)生抗藥性等問題。因此，Bt殺蟲晶體蛋白至今尚未在無公害蔬菜等綠色食品生產(chǎn)上發(fā)揮出應(yīng)有的作用，但是該ZwA對(duì)Bt的晶體蛋白殺蟲毒力具有增效作用，殺蟲活性可以提高幾倍到幾千倍。

Bt與Bc類似也產(chǎn)生抗生素，該抗生素自身殺蟲活性極低，因此，抗生素可作為增效因子來提高Bt的生物防治功效，從而減少Bt制劑的使用量，延緩害蟲抗性的產(chǎn)生，拓寬殺蟲譜。抗生素還具有抑制疫霉和腐霉的作用，當(dāng)病原菌侵染植物前，可直接用抗生素噴霧，達(dá)到防治植物病害的目的。因此，ZwA作為一種新型的抗生素，具有很高的研究價(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1994年發(fā)現(xiàn)的ZwA抗生素分子量是396，來自于蠟狀芽胞桿菌；其次，過去文章、專利、成果涉及到了Bc和Bt的ZwA抗生素分子量都是396，沒有涉及到其它分子量的ZwA抗生素。

我們首次從國際通用編號(hào)HD-1或?qū)憺镠D1的Bt菌株發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)分子量364和382兩個(gè)水溶性ZwA抗生素，寫為ZwA₃₆₄和ZwA₃₈₂。以示與以往396分子量ZwA₃₉₆抗生素相區(qū)別。ZwA₃₆₄和ZwA₃₈₂與ZwA₃₉₆相比較，除了分子量有所差異之外，在抑菌性、茚三酮比色法檢測等方面相同，它們屬于共同的ZwA抗生素家族。

早在1969年Bt的HD-1菌株被篩選出來，世界上許多學(xué)者研究過該菌株，但是由于種種原因一直以為該菌株產(chǎn)生ZwA₃₉₆抗生素。

本申請(qǐng)將公開HD-1或?qū)憺镠D1的發(fā)酵液中的364和382分子量的兩個(gè)水溶性ZwA₃₆₄和ZwA₃₈₂抗生素的發(fā)現(xiàn)及其純化制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種水溶性抗生素的分離純化制備方法。

整套方法由九大步驟組成，缺一不可，并且要按照以下九大步驟的順序進(jìn)行。包括：(1)制備培養(yǎng)基；(2)制備發(fā)酵種子菌液；(3)擴(kuò)大發(fā)酵的條件；(4)抗生素ZwA的第一次純化萃取法；(5)抗生素ZwA的第二次純化大孔樹脂法；(6)抗生素ZwA的第三次純化硅膠層析法；(7)高效液相色譜法純度檢測；(8)質(zhì)譜法分子量定性分析；(9)結(jié)論。

具體步驟為：

(1)制備培養(yǎng)基

1.1斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3-6g，蛋白胨5-15g，氯化鈉3-7g，瓊脂粉10-20g，pH7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用。

1.2菌株HD-1種子培養(yǎng)基：酵母膏3-7g，蠶蛹蛋白膏5-15?g，氯化鈉5-15?g，pH7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用。

1.3初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10-30g，蠶蛹蛋白膏10-30g，CaCL_2?0.05-0.10g，K₂HPO₄?1-2g，MgSO₄?0.1-0.3g，MnSO₄?0.05-0.1g，pH?7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用。