[發(fā)明專利]一種水溶性抗生素的分離純化制備方法

有效

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• 申請日: 2014-03-09
• 公開（公告）號: CN103805645A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設計）人: 郝再彬;李霞;嚴麗;張杰;宋福平
• 申請（專利權）人: 桂林理工大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C07K1/20;C07K1/14;C07K1/16;C12R1/18
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1.一種水溶性抗生素的分離純化制備方法，其特征在于具體步驟為：

(1)制備培養(yǎng)基

1.1斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3-6g，蛋白胨5-15g，氯化鈉3-7g，瓊脂粉10-20g，pH7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用；

1.2菌株HD-1種子培養(yǎng)基：酵母膏3-7g，蠶蛹蛋白膏5-15?g，氯化鈉5-15?g，pH7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用；

1.3初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10-30g，蠶蛹蛋白膏10-30g，CaCL_2?0.05-0.10g，K₂HPO₄?1-2g，MgSO₄?0.1-0.3g，MnSO₄?0.05-0.1g，pH?7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用；

1.4擴大生產發(fā)酵培養(yǎng)基：蠶蛹蛋白膏7-11g，葡萄糖2-5g，氯化鈉?1-4g，MgSO₄·7H₂O?0.2-0.4g，K₂HPO₄?0.2-0.4g，MnSO₄?0.02-0.07g，pH7.5，定容至1L，121℃滅菌30min備用；

1.5供試菌活化培養(yǎng)基：牛肉膏2-8g，蛋白胨5-15g，氯化鈉2-8g，pH?7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用；

1.6抑菌活性測定固體培養(yǎng)基：牛肉膏2-8?g，蛋白胨5-15?g，氯化鈉5-20?g，瓊脂粉10-20g，pH?7.0-7.2，定容至1L，121℃滅菌30min備用；

(2)制備發(fā)酵種子菌液

首先，將保存于-20℃冰箱的甘油保藏菌種HD-1放到室溫復蘇，至完全解凍，將其接種到LB斜面培養(yǎng)基上，30℃過夜培養(yǎng)，取出后保存于4℃冰箱備用；然后，從保存好的HD-1斜面培養(yǎng)基上取0.5㎝×1.0㎝大小的斜面培養(yǎng)物接種于300mL搖瓶中，內含有種子培養(yǎng)基100mL，置于220r/min搖床30℃培養(yǎng)10-20?h；

2.1菌株HD-1發(fā)酵液的制備

將活化好的HD-1種子培養(yǎng)基以2%的接種量接種到滅過菌的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不超過容器體積的2/3，30℃搖瓶培養(yǎng)20-40?h，然后，5000-10000r/min離心5-15min、收集上清，4℃冰箱保存，此過程有抗生素生物合成；

2.2初次抑菌活性檢測

采用管碟法，以草生歐文氏桿菌為指示菌，檢測濃縮10倍后的HD-1發(fā)酵液上清液的抑菌活性，空白培養(yǎng)基作對照，將甘油保存的草生歐文氏桿菌菌種接種到活化培養(yǎng)基中，30℃搖瓶培養(yǎng)10-15h，然后2%的接種量將菌液加入到冷卻至45℃的抑菌活性測定固體培養(yǎng)基中，輕搖混勻，先在滅菌的玻璃培養(yǎng)皿內加注無菌固體培養(yǎng)基作為底層，冷卻后擺放牛津環(huán)，再將混勻的加菌液的固體培養(yǎng)基輕輕加入到底層培養(yǎng)基上，雙層培養(yǎng)基都要薄而均勻，靜置冷卻后，用滅過菌的鑷子輕輕取下牛津環(huán)，在孔中加入待測液，液面和上層培養(yǎng)基面齊平，然后，在28℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)10-15h，測其抑菌圈直徑大小，抑菌直徑為抑菌圈外徑減去牛津環(huán)外徑，在做抑菌試驗時，將上清液95℃水浴15min后，用1mol/L的NaOH調至中性或偏堿性，驗證抗生素的存在，由于ZwA的濃度與抑菌圈直徑存在線性關系，因此，將以抑菌圈的直徑來間接表示ZwA濃度；

(3)擴大發(fā)酵的條件

3.1發(fā)酵培養(yǎng)基：采用18L發(fā)酵罐培養(yǎng)，罐內裝培養(yǎng)基不能超過體積的2/3，以5-15L為宜；

3.2發(fā)酵時間：將活化好的搖瓶種子培養(yǎng)基接種到擴大生產發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-40h；

3.3培養(yǎng)溫度：將活化好的搖瓶種子培養(yǎng)基接種到擴大生產發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20℃-40℃恒溫下培養(yǎng)；

3.4培養(yǎng)基初始pH：將已接種的擴大生產發(fā)酵培養(yǎng)基，用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH調pH值5.0-10.0；

(4)抗生素ZwA的第一次純化萃取法

取10L發(fā)酵液分批次5000-10000r/min離心，5-20min，回收上清液，用1mol/L的HCl調至pH4.0，在50℃下真空濃縮，真空度-0.095--0.088Mpa，濃縮至200mL，加入100mL無水乙醇，輕輕搖勻，靜置1小時后再次5000-10000r/min離心5-20min，取上清，上清液用等體積的石油醚萃取后，收集水相，至無醇味和石油醚味，加水補至原體積，即得ZwA粗提液，做抑菌試驗驗證ZwA的存在，之后保存于4℃冰箱備用；

(5)抗生素ZwA的第二次純化大孔樹脂法

根據ZwA的水溶性強、弱極性等特點，選用非極性大孔樹脂LX-68M、LX-22、LX-762及LXA-8對ZwA進行初步純化；

5.1大孔樹脂預處理：稱取一定量的濕重樹脂，使用前均做預處理，流程如下，首先，將稱好的樹脂裝入玻璃層析柱中(60cm×2cm)，用2倍柱床體積的1mol/L的HCl溶液以1mL/min的流速對樹脂層進行洗脫，并浸泡樹脂4h，然后用去離子水以同樣流速沖洗樹脂，至流出水pH?呈中性；然后用2倍柱床體積的1mol/L的NaOH溶液以1mL/min的流速對樹脂層進行洗脫，并浸泡樹脂4?h，用去離子水以同樣流速沖洗樹脂，至流出水pH?呈中性；再用1倍柱床體積的乙醇浸泡樹脂6h；用2倍柱床體積的乙醇以1mL/min?的流速通過樹脂柱，再浸泡樹脂4h；再用去離子水以同樣流速洗至無乙醇味為止；

5.2?ZwA的純化：按樹脂量與粗提液1:2(W/V)的比例，分別上樣10mL，濕法裝柱，室溫靜態(tài)吸附3h后，先用去離子水動態(tài)洗脫，洗脫體積初定4倍柱床體積，洗脫液為未吸附相，再用50%的乙醇洗脫4倍柱床體積，洗脫組分為A，再用無水乙醇洗脫4倍柱床體積，洗脫組分為B，洗脫時流速約0.5mL/min，分別收集洗脫液，減壓濃縮后去離子水定容至10mL，對A和B分別做抑菌試驗驗證ZwA的存在，之后保存于4℃冰箱備用；

(6)抗生素ZwA的第三次純化硅膠層析法

稱取100-140目硅膠150g，用無離子水浸泡3h，沖洗，抽干，再用濃鹽酸洗滌以除去殘留的雜質，然后用去離子水洗至中性，抽干，再用無水乙醇浸泡過夜，抽干，臨用前120℃烘干至恒重，再用無離子水浸泡過夜即可裝60cm×2cm層析柱；

6.1裝柱與ZwA的上樣：采用濕法裝柱，干法上柱；用無離子水將浸泡過夜的硅膠攪拌成勻漿，緩慢加入玻璃層析柱中，60cm×2cm層析柱，多余無離子水洗脫劑流出，上層加入4cm的石油醚，然后取5mL大孔樹脂第二次純化后的樣品ZwA，加入適量干硅膠攪拌至干粉狀，緩慢加入層析柱的上層石油醚液中，目的是使樣品暫時與洗脫劑分開，避免洗脫劑夾帶樣品快速流下，裝柱要確保層析柱均勻，實在、無氣泡、無斷層；柱床總高度約30-50cm；

6.2?ZwA的純化：洗脫劑為乙酸乙酯:甲醇=70:30(V:V)，洗脫速度為0.5mL/min，用部分收集器分段收集，每管10mL，以紫外吸收法在線監(jiān)測ZwA樣品的紫外吸收出現(xiàn)，以2%茚三酮比色法在565nm波長下檢測ZwA樣品的顏色出現(xiàn)，直到無ZwA樣品的紫外吸收出現(xiàn)、無ZwA樣品的顏色出現(xiàn)時，終止洗脫，共收集30管，根據顏色一致性合并為10管，對各管溶液做抑菌試驗驗證ZwA的存在，之后保存于4℃冰箱備用；

6.3?ZwA樣品的冷凍干燥處理：使用冷凍干燥機對上述各管液體進行冷凍干燥處理，冷凍干燥至無水成為干粉，之后保存于4℃冰箱備用；

6.4茚三酮比色反應

6.4.1配置pH6.7的磷酸鹽緩沖溶液：分別稱取磷酸二氫鉀4.5350g和磷酸氫二鈉11.9380g于小燒杯中，用少量去離子水溶解后，移入500ml容量瓶中，再用去離子水定容至刻度，搖勻備用，取55.?0ml磷酸二氫鉀溶液與45.?0ml磷酸氫二鈉溶液混合搖勻，即得到pH6.7的磷酸鹽緩沖溶液；

6.4.2配置2%茚三酮顯色液：分別稱取2.0000g茚三酮和1.0000g氯化鉻，加入乙二醇緩慢加熱至完全溶解，轉入100ml容量瓶中，再用磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度，搖勻，放置過夜，次日用，若有沉淀，過濾后使用；

6.4.3顯色反應：取各管洗脫液分別0.5mL，2%茚三酮0.5mL，磷酸鹽緩沖溶液1mL，于10mL帶刻度試管中，搖勻后沸水浴15min，冷卻10min，用去離子水定容至10mL，搖勻，穩(wěn)定15min后測量，以洗脫劑作空白對照，用紫外分光光度計先進行全190-800nm波長掃描，確定其最大紫外吸收波長，然后測定各樣品在最大吸收波長下的吸光度A，繪制洗脫曲線；

(7)高效液相色譜法純度檢測：

7.1檢測樣品制備：分別取6.3的干粉樣品，分別用1毫升無離子水溶解，備用；

7.2高效液相色譜法檢測：將7.1的10個組分別做HPLC檢測，用面積歸一法分析其純度；

色譜條件：反相C₁₈分析柱，流動相為水:甲醇=85:15(V/V)，紫外檢測器，檢測波長210nm，流度0.5mL/min，進樣量10μL，柱溫35℃；

7.3再次用抑菌活性法檢測：采用管碟法，對7.1的10個組分進行抑菌活性檢測，進一步確定純化后ZwA的富集區(qū)段；

(8)質譜法分子量定性：

質譜檢測：稱取0.0100g，用質譜檢測儀鑒定其分子量；

質譜檢測條件：電噴霧離子源即ESI，毛細管電壓為3.5kV，?錐孔電壓為150V，離子源溫度為100℃，干燥氣溫度為300℃，脫溶劑氣體流速500L/h，錐孔氣體流速為50L/h，水作溶劑；

(9)結論：

由(8)質譜分析圖確定，所制得的水溶性抗生素中含有364和382兩種分子量的分子結構；

所述分子量為364的水溶性抗生素的分子結構為：

；

所述分子量為382的水溶性抗生素的分子結構為：

。