[發明專利]一種HRMA檢測華支睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲的方法

無效

• 申請號: 201410081323.8
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103866015A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 蔡先全
• 申請（專利權）人: 蔡先全
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標事務所(普通合伙) 44286
• 代理人: 吳劍鋒

技術領域

本發明涉及一種高分辨率熔解曲線分析（HRMA）檢測華支睪吸蟲的方法，屬于生物檢測領域。

背景技術

中華支睪吸蟲Clonorchis?sinensis,簡稱華支睪吸蟲，又稱肝吸蟲（liver?fluke）。成蟲寄生于人體的肝膽管內，可引起華支睪吸蟲病（Clonorchiasis），又稱肝吸蟲病，華支睪吸蟲為我國最重要的食源性寄生蟲。本蟲于1874年首次在加爾各答一華僑膽管內發現，1908年才在我國證實該病存在。1975年在我國湖北江陵西漢古尸糞便中發現本蟲蟲卵，繼之又在該縣戰國楚墓古尸見該蟲卵，從而證明華支睪吸蟲病在我國至少已有2300年以上歷史。華支睪吸蟲病主要分布在亞洲，如中國、日本、朝鮮、越南和東南亞國家。在我國除青海、寧夏、內蒙古、西藏等尚未見報道外，其余25個省、市、自治區都有不同程度流行。據1988～1992年全國寄生蟲病調查報道，全國平均感染率為0.365%，平均感染率最高為廣東省（1.824%）。華支睪吸蟲病的流行，除需有適宜的第一、第二中間宿主及終宿主外，還與當地居民飲食習慣等諸多因素密切相關。麝貓后睪吸蟲形態、生活史、致病機理都與華支睪吸蟲密切相關，是原發性膽管細胞型肝癌的確定致病因素。麝貓后睪吸蟲流行的國家(泰國、老撾等)原發性膽管細胞型肝癌的發生率高，泰國膽管細胞型肝癌的發生率最高(87/10萬)。

高分辨熔解曲線分析(high-resolution?melt?analysis，HRMA)技術是近幾年來在國外興起的一種用于物種鑒定的最新遺傳學分析方法。它是一種高效穩健的分子檢測技術，不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨熔解曲線分析，即可完成對物種鑒定、基因分型等的分析。因操作簡便快速，使用成本低，結果準確，實現了真正的閉管操作。

HRMA利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結合情況記錄熔解曲線，從而對樣品進行檢測。雖然帶HRM模塊的熒光PCR儀與普通熒光PCR儀購買價格相差不大，但其溫度均一性要高很多。如普通定量PCR儀溫度均一性±0.25℃，溫度分辨率為0.1℃，而Rotor-Gene6000溫度均一性為±0.01℃，溫度分辨率為0.02℃。其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達到對單個堿基差異的區分，加上飽和性染料（LC?Green、Eva?Green等）的出現，使得HRM這一技術的普及使用成為可能。

目前，華支睪吸蟲的檢測方法主要有傳統鏡檢方法和分子檢測方法。其中傳統方法，存在操作繁瑣、難鑒別、易漏檢等缺點。分子檢測方法中，包括了常規PCR方法，但是常規PCR需要擴增后進行電泳，操作復雜而且極易引起污染。而探針法PCR則存在檢測成本很高，試劑保存期短等缺點。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，檢測結果準確，使用成本低的高分辨率熔解曲線分析同時檢測華支睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲的方法。

為了達到上述目的，本發明采用以下方案：

一種HRMA檢測華支睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、根據華支睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲COX1基因設計引物對；所述引物對的上游引物序列為：5‘-GGTAGGGTGGTTTGAGC-3’，所述引物對的下游引物序列為：5‘-TCATAGTAACCGAGCTAAA-3’；

B、提取樣本DNA后，利用設計的引物對進行非標記熒光PCR擴增；

C、應用帶HRM模塊的熒光PCR儀軟件對PCR擴增產物進行高分辨率熔解曲線分析，確定擴增產物的Tm值熔解曲線圖譜。

如上所述一種HRMA檢測華支睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲的方法，其特征在于步驟B中所述非標記熒光PCR擴增過程是在反應液中進行的，其中制備20μL的反應液由以下組分組成：

如上一種HRMA檢測華支睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲的方法，其特征在于步驟B中非標記熒光PCR擴增的擴增反應按以下步驟進行：

（1）92℃～96℃預變性30s；

（2）92℃～96℃變性10～30s,55-63℃退火10～30s,72℃10～30s,共進行40～50個循環；

（3）72℃延伸10～30s。

如上所述的一種HRMA檢測華支睪吸蟲、麝貓后睪吸蟲的方法，其特征在于步驟C中對PCR擴增產物高分辨率熔解曲線分析，按以下步驟進行：