[發明專利]一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物及其應用

有效

• 申請號: 201410081273.3
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103805710A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 王暄;李紅梅;顧建鋒;魏洪巖
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，涉及一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物及其應用。

背景技術

水稻干尖線蟲（Aphelenchoides?besseyi），又稱貝西滑刃線蟲，是水稻上重要的種傳外寄生線蟲，世界范圍內各水稻產區均有發生^[1]，能引起水稻干尖或白尖病^[2]。水稻干尖線蟲病于1915年在日本九州島發現^[3]，大約20世紀40年代傳入中國，曾被列為中國對內檢疫對象^[4]，后因采取檢疫及種子處理等措施，該病害在80年代得到控制。但是近年來，該病害的發生范圍和危害程度在我國又開始加大，目前，廣東、廣西、湖南、湖北、浙江、江蘇、安徽、山東、河北、上海、遼寧、陜西、貴州、四川、云南、臺灣等地的主要稻區均有分布，局部地區發生和危害嚴重^[5]。為了阻止水稻干尖線蟲病傳播范圍的不斷擴大，對其進行快速、準確地檢測鑒定尤為重要。

傳統的水稻干尖線蟲檢測方法，主要以形態學鑒定為主，但由于線蟲形態特征細微復雜，且常具有一定的變化，因此鑒定往往比較困難，需要專業人士操作，過程費時費力，且需要大量線蟲樣本，在單條線蟲水平上難以準確鑒定。近年來隨著分子生物學相關技術的發展，基于PCR的方法已經成功用于檢測水稻干尖線蟲^[6]，盡管以PCR為基礎的分子鑒定方法一定程度上克服了傳統形態鑒定上的缺陷，但由于檢測需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統儀等昂貴的專業儀器設備，同時需要操作人員具有一定的分子生物學專業技能，并且只能在實驗室條件下完成，需要較長的時間，檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求，限制了PCR檢測方法在生產中的推廣應用。

環介導等溫擴增技術（Loop‐mediated?isothermal?amplification,LAMP）是Notomi等開發的一種恒溫擴增方法^[7]，該方法針對靶基因的6個位點設計出4條引物，利用一種具有鏈式置換活性的DNA聚合酶(Bst?DNApolymerase)，在恒溫條件下(60℃左右)保溫30‐90分鐘，即可完成擴增反應。由于該反應過程中產生焦磷酸鎂沉淀物，出現渾濁沉淀，因此用肉眼就判定擴增結果，也可通過向其擴增產物中添加熒光染料通過顏色變化來判斷，因此不需要專業的儀器設備，在普通水浴鍋中或者其他穩定熱源即可完成，具有簡單、快速、高效、經濟等特征。

憑借快速靈敏的優越性，LAMP技術已在松材線蟲^[8]（Bursaphelenchuh?xylophilus）、南方根結線蟲^[9]（Meloidogyne?incognita）、象耳豆根結線蟲^[10]（Meloidogyne?enterolobii）、香蕉穿孔線蟲^[11]（Radopholus?similis）等植物寄生線蟲快速檢測中得到了應用，極大的提高了針對上述植物寄生線蟲的鑒定效率和準確率，為進一步采取適宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在水稻干尖線蟲中尚無相關報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物。

本發明的另一目的是提供該引物組合物的應用。

本發明的又一目的是提供一種水稻干尖線蟲LAMP快速檢測方法。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物，由以下引物組成：AB1-F3：SEQ?ID?NO.2，AB1-B3：SEQ?ID?NO.3，AB1-BIP：SEQ?ID?NO.4，AB1-FIP：SEQ?ID?NO.5，AB1-LF：SEQ?ID?NO.6。

本發明所述的引物組合物在檢測和/或鑒定水稻干尖線蟲中的應用。

本發明所述的引物組合物在制備水稻干尖線蟲檢測和/或鑒定試劑中的應用。

一種水稻干尖線蟲檢測試劑，包含本發明所述的引物組合物。

一種水稻干尖線蟲LAMP快速檢測方法，包括以下步驟：

（1）提取待檢樣品DNA；

（2）以提取的DNA為模板，利用本發明所述的LAMP引物組合物進行LAMP擴增；

（3）LAMP擴增反應結束按照以下任意一種方式觀察結果：

1)向擴增產物中加入顯色劑，輕晃混勻，即可觀察，擴增產物具有綠色熒光，表明含有水稻干尖線蟲；