[發(fā)明專利]一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測(cè)的引物組合物及其應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410081273.3 | 申請(qǐng)日: | 2014-03-06 |
| 公開(公告)號(hào): | CN103805710A | 公開(公告)日: | 2014-05-21 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 王暄;李紅梅;顧建鋒;魏洪巖 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號(hào): | C12Q1/68 | 分類號(hào): | C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司: | 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218 | 代理人: | 傅婷婷;徐冬濤 |
| 地址: | 211225 江蘇省南京市溧*** | 國省代碼: | 江蘇;32 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 用于 水稻 線蟲 lamp 快速 檢測(cè) 引物 組合 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測(cè)的引物組合物,其特征在于:由以下引物組成:
AB1-F3:SEQ?ID?NO.2,AB1-B3:SEQ?ID?NO.3,AB1-BIP:SEQ?ID?NO.4,AB1-FIP:SEQ?ID?NO.5及AB1-LF:SEQ?ID?NO.6。
2.權(quán)利要求1所述的引物組合物在檢測(cè)和/或鑒定水稻干尖線蟲中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的引物組合物在制備水稻干尖線蟲檢測(cè)和/或鑒定試劑中的應(yīng)用。
4.一種水稻干尖線蟲檢測(cè)試劑,其特征在于包含權(quán)利要求1所述的引物組合物。
5.一種水稻干尖線蟲LAMP快速檢測(cè)方法,其特征在于包括以下步驟:
(1)提取待檢樣品DNA;
(2)以提取的DNA為模板,利用權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增;
(3)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束按照以下任意一種方式觀察結(jié)果:
1)向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑,輕晃混勻,即可觀察,擴(kuò)增產(chǎn)物具有綠色熒光,表明含有水稻干尖線蟲;
2)取擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳,EB染色,在紫外燈下觀測(cè),擴(kuò)增產(chǎn)物呈梯形條帶,表明含有水稻干尖線蟲;
3)將反應(yīng)后的離心管3000rpm離心30sec,管底觀察到白色沉淀,表明含有水稻干尖線蟲。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法,其特征在于步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25μl,由
1)引物混合液:外引物AB1-F3和AB1-B3各0.2μmol/L,內(nèi)引物AB1-FIP和AB1-BIP各0.8μmol/L,環(huán)引物AB1-LF為0.4μmol/L;
2)反應(yīng)混合液:0.8mmol/L?dNTP,20mmol/L?Tris-HCl(pH8.8),10mmol/L?KCl,5mmol/L?MgCl2,10mmol/L(NH4)2SO4,0.1%Triton?x-100,0.2mol/L甜菜堿,8U?Bst?DNA聚合酶大片段;
3)1μl?DNA模板;
4)滅菌雙蒸餾水組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法,其特征在于步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:61~65℃保溫30~90min,85℃保溫10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法,其特征在于所述的顯色劑為SYBR?green?I與PCR級(jí)DMSO以1:9體積比的混合物。
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