[發(fā)明專利]一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測(cè)的引物組合物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410081273.3
• 申請(qǐng)日: 2014-03-06
• 公開（公告）號(hào): CN103805710A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王暄;李紅梅;顧建鋒;魏洪巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測(cè)的引物組合物，其特征在于：由以下引物組成：

AB1-F3：SEQ?ID?NO.2，AB1-B3：SEQ?ID?NO.3，AB1-BIP：SEQ?ID?NO.4，AB1-FIP：SEQ?ID?NO.5及AB1-LF：SEQ?ID?NO.6。

2.權(quán)利要求1所述的引物組合物在檢測(cè)和/或鑒定水稻干尖線蟲中的應(yīng)用。

3.權(quán)利要求1所述的引物組合物在制備水稻干尖線蟲檢測(cè)和/或鑒定試劑中的應(yīng)用。

4.一種水稻干尖線蟲檢測(cè)試劑，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的引物組合物。

5.一種水稻干尖線蟲LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）提取待檢樣品DNA；

（2）以提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；

（3）LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束按照以下任意一種方式觀察結(jié)果：

1)向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑，輕晃混勻，即可觀察，擴(kuò)增產(chǎn)物具有綠色熒光，表明含有水稻干尖線蟲；

2)取擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳中電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物呈梯形條帶，表明含有水稻干尖線蟲；

3)將反應(yīng)后的離心管3000rpm離心30sec，管底觀察到白色沉淀，表明含有水稻干尖線蟲。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟（2）所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25μl，由

1）引物混合液：外引物AB1-F3和AB1-B3各0.2μmol/L，內(nèi)引物AB1-FIP和AB1-BIP各0.8μmol/L,環(huán)引物AB1-LF為0.4μmol/L；

2）反應(yīng)混合液：0.8mmol/L?dNTP，20mmol/L?Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L?KCl，5mmol/L?MgCl₂，10mmol/L(NH4)₂SO₄，0.1%Triton?x-100，0.2mol/L甜菜堿，8U?Bst?DNA聚合酶大片段；

3）1μl?DNA模板；

4）滅菌雙蒸餾水組成。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟（2）所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：61～65℃保溫30～90min，85℃保溫10min。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的顯色劑為SYBR?green?I與PCR級(jí)DMSO以1：9體積比的混合物。