[發(fā)明專利]一種檢測黃曲霉毒素M1的熒光微球免疫層析試紙條及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410079913.7
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN104897863A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬宇平;馮才偉;趙正苗;何方洋;朱亮亮;馮靜;崔海峰;余厚美
• 申請（專利權(quán)）人: 北京勤邦生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/04
• 分類號: G01N33/04;G01N33/577
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測黃曲霉毒素M1的試紙條及方法，具體涉及一種用于檢測牛奶中黃曲霉毒素M1的熒光微球免疫層析試紙條。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是迄今發(fā)現(xiàn)污染農(nóng)產(chǎn)品毒素最強(qiáng)的一類生物毒素，也是強(qiáng)致癌物。最為常見的有AF?B1、B2、G1、G2，其中AF?B1的存在量與毒性都是最大的。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的4-羥基衍生物，是B1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物，一部分從尿和乳汁排出，另一部分存在于動物的可食部分中。主要存在于土壤、動植物、霉變谷物、各種堅(jiān)果、食品、調(diào)味品、食用油、牛奶和奶制品等霉變制品中，直接或間接進(jìn)入人類食物鏈，是致癌致畸致突變的毒物，嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全。牛乳及其制品是易受到黃曲霉毒素污染的食品之一。為保證其安全衛(wèi)生，各國都制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。美國FDA規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1的限量水平為0.5μg/kg，我國也規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過0.5μg/kg。

目前，對黃曲霉毒素檢測的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、免疫分析法、質(zhì)譜法、免疫親和熒光光度法等。薄層色譜法操作繁瑣、污染大、定量差、耗時長；高效液相色譜法具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、特異性好和測定結(jié)果可靠等特點(diǎn)，但如果食品成分復(fù)雜，在進(jìn)行液相色譜分離前，需對樣品作徹底有效的凈化處理，不適合于大批量樣品的檢測，應(yīng)用受到限制；酶聯(lián)免疫吸附法是目前常使用的一種檢測方法，它具有快速、靈敏、對樣品純度要求不高等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于大批量樣品的檢測，熒光免疫層析法與酶聯(lián)免疫法相比檢測時間更短，穩(wěn)定性好、操作簡便、無需其他儀器設(shè)備，結(jié)果判斷直觀可靠，適用于現(xiàn)場進(jìn)行快速篩選。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測黃曲霉毒素M1的熒光微球免疫層析試紙條。

本發(fā)明所提供的檢測黃曲霉毒素M1的熒光微球免疫層析試紙條，其特征在于包括由樣品結(jié)合墊、層析膜、吸水墊和底襯組成的試紙條；所述樣品結(jié)合墊上含有熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素M1單克隆抗體；所述層析膜上有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被有黃曲霉毒素M1半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體。所述樣品結(jié)合墊是將熒光微球抗體偶聯(lián)物以特定緩沖體系稀釋后，將樣品結(jié)合墊浸泡于稀釋緩沖液中，經(jīng)真空冷凍干燥后制備而得；所述熒光微球是內(nèi)部包埋熒光染料、表面修飾有羧基官能團(tuán)的微球懸液，熒光微球由聚苯乙烯包被，粒徑100～300nm，固體含量1%～10%，官能團(tuán)密度100～600uEq/g。

所述的熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素M1單克隆抗體是通過EDC和NHS介導(dǎo)的與蛋白表面氨基的酰胺化反應(yīng)制備獲得的。

所述的黃曲霉毒素M1半抗原是由黃曲霉毒素M1與對苯二胺反應(yīng)獲得，包括如下步驟：

65mg黃曲霉毒素M1溶于1mL二甲基亞砜（DMSO），60℃下緩慢滴加入25mg對苯二胺和0.1mL吡啶在1mL?DMSO的混合液中，滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)15h，旋蒸除去溶劑，柱層析純化后得到黃曲霉毒素M1的對苯二胺單縮合物。

所述熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素M1單克隆抗體的黃曲霉毒素M1單克隆抗體是以黃曲霉毒素M1半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的。

所述黃曲霉毒素M1半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由黃曲霉毒素M1半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺蛋白、血藍(lán)蛋白、人血清白蛋白。

所述樣品結(jié)合墊是將樣品結(jié)合墊置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在緩沖體系中的終濃度為0.5%體積百分含量）、pH7.2、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中均勻浸泡2h，將處理完的樣品結(jié)合墊平鋪于干燥網(wǎng)上置于37℃干燥室干燥2h（濕度要求30%），將熒光微球抗體偶聯(lián)物以貯存緩沖液稀釋后，將樣品結(jié)合墊浸泡于其中經(jīng)真空冷凍干燥后制備而得，備用。

所述底襯為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品結(jié)合墊為玻璃纖維膜；所述吸水墊為吸水紙；所述層析膜為硝酸纖維素膜。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述黃曲霉毒素M1熒光微球免疫層析試紙條的方法，其包括步驟：

1）制備黃曲霉毒素M1單克隆抗體；

2）制備熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素M1單克隆抗體，并在樣品結(jié)合墊中包埋熒光微球抗體偶聯(lián)物；

3）將樣品結(jié)合墊、層析膜、吸水墊由一端依次粘貼在底襯上組裝成試紙條；

4）切割、組裝成試紙條用于檢測黃曲霉毒素M1。

具體地說，步驟包括：

1）將黃曲霉毒素M1與對苯二胺反應(yīng)，制備黃曲霉毒素M1半抗原；