[發(fā)明專利]一種利用雙酶協(xié)同水解制備金屬螯合肽的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410079702.3
• 申請(qǐng)日: 2014-03-06
• 公開（公告）號(hào): CN103788193A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪少蕓;唐夢(mèng)茹;何慶燕;邵彪;方衛(wèi)東;趙立娜;江勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/46
• 分類號(hào): C07K14/46;C12P21/06;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種金屬（Ca、Fe、Zn）螯合肽，更具體地涉及了一種利用雙酶協(xié)同水解制備金屬螯合肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

海洋蛋白源生物活性肽具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、食用安全性及生理保健功能，在促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病防治等方面都起著重要的作用，可作為功能性食品或食品添加劑乃至藥品應(yīng)用到人們?nèi)粘Ｉ钪小?/p>

鈣質(zhì)缺乏是全球性的營(yíng)養(yǎng)問題，我國(guó)人民由于以植物性膳食為主，缺鈣的現(xiàn)象更加嚴(yán)重，因此補(bǔ)鈣成為我國(guó)膳食營(yíng)養(yǎng)研究中的重要課題。傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)鈣鹽，如碳酸鈣、磷酸鈣、氯化鈣等，對(duì)維生素有一定破壞作用，生物學(xué)效價(jià)較低；有機(jī)鈣鹽，如檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖鈣等，雖然鈣吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且價(jià)格高。研究表明，多肽螯合鈣由于其獨(dú)特的螯合體制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，易被吸收、安全無(wú)毒、價(jià)格低、可同時(shí)補(bǔ)充氨基酸和鈣，而成為補(bǔ)鈣首選。

鐵對(duì)人類健康特別是對(duì)嬰幼兒和兒童的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。雖然大分子蛋白質(zhì)也可以與鐵離子結(jié)合，但這些大分子蛋白質(zhì)本身也存在相對(duì)分子質(zhì)量較大而很難通過腸黏膜的問題。而研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸、多肽螯合鐵可以大大提高鐵離子的吸收率。

盡管自然界中鋅源十分豐富，但鋅在人體內(nèi)的吸收代謝受種種因素的限制，鋅缺乏已成為我國(guó)及許多發(fā)展中國(guó)家的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)氨基酸和小肽具有促進(jìn)鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬?gòu)?fù)合體如?Fe、Zn的生物學(xué)利用率比無(wú)機(jī)鹽高且無(wú)毒副作用。因此，研究開發(fā)這種生物態(tài)鋅-蛋白酶解物螯合鋅，具有十分重要的意義。

因此，如何獲得具有金屬螯合活性的肽，就成為制備新型金屬元素補(bǔ)充劑迫切的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用雙酶協(xié)同水解制備金屬螯合肽的方法，使金屬（Ca、Fe、Zn）螯合活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種金屬螯合肽，是由6個(gè)氨基酸所構(gòu)成的肽，所述肽的氨基酸序列為：kngedg。

所述的金屬為Ca、Fe或Zn。

一種金屬螯合肽的制備方法，以海洋源魚皮、魚鱗蛋白為原料，采用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)配對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。

酶解條件為：底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49℃、酶解時(shí)間為7小時(shí)、酶-底物重量配比為1:25；所述酶為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，兩種酶的重量復(fù)配比為復(fù)合蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶=?2:1。

所述分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用TOYOPEARL?DEAE-650M陰離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5?mol/L?NaCl的0.02?mol/L、pH?9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5?mL/min，洗脫峰在214?nm下進(jìn)行測(cè)量；收集具有最高金屬螯合活性的峰，再用Sephadex?G-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3?mL/min，洗脫峰在214?nm下進(jìn)行測(cè)定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用半制備RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步分離，分離條件是用體積比為0-30%乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為4?mL/min，收集具有最高金屬螯合活性的峰，再利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為1mL/min，洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比5%乙腈和85%水處的洗脫峰，得到金屬螯合肽。

本發(fā)明立足于多肽具備與金屬離子螯合的作用位點(diǎn)，能夠與其形成穩(wěn)定的化合物，且多肽-金屬螯合物具有獨(dú)特的螯合體制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，易被吸收、可同時(shí)補(bǔ)充氨基酸和金屬的理論基礎(chǔ)，以來(lái)自于魚皮、魚鱗蛋白為原材料，通過復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶的切割條件控制，切割制備具有高金屬（Ca、Fe、Zn）螯合活性的肽，而使金屬螯合活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明為海洋源蛋白的應(yīng)用提供了一條新思路。

附圖說明

圖1??純化海洋源蛋白金屬螯合肽的CLC－HPLC-C18色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

制備方法如下：

(1)??海洋源蛋白酶解條件的優(yōu)化