[發明專利]一種基于質粒庫的無引物基因合成方法

有效

• 申請號: 201410079262.1
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103952396A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 馬立新;陳晚蘋
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

1.一種基于質粒庫的無引物基因合成方法，其特征在于該方法通過構建一個包含有7bp的A、T、C、G四個堿基的任意組合序列的16384（4⁷?）個質粒的質粒庫，從已構建好的含有7個bp的質粒出發，將選定的目標基因按照每82bp進行劃分，通過酶切酶連操作依次進行Kana、cam、gem、spc四種抗性基因的重構，得到若干含82bp的質粒，?然后再把這些82bp質粒組裝合成長片段基因。

2.根據權利要求1所述的一種基于質粒庫的無引物基因合成方法，其特征在于具體做法如下：

1）、構建抗性基因重構載體pNew

a)、構建線性載體骨架pNew，

b)、構建線性載體骨架5SGCK，

c)、構建線性載體骨架3KCGS，

d)、無酶克隆組裝pNew載體質粒，

通過無酶克隆的方式把3個片段：線性載體骨架pNew、5SGCK、3KCGS克隆到一個完整的載體上，經過限制性內切酶酶切和測序鑒定得到正確的pNew載體質粒；

2）、用已構建好的pNew載體，用常規方法構建4^7?(16384)種質粒庫，包含有7bp四種堿基對序列的任一質粒；

3）、選擇目標基因，將目的基因DNA序列按照每82bp進行劃分為G1、G2、G3、G4、G5……多個小片段，每個片段之間有3個堿基的重復，依次重構Kana、cam、gem、spc抗性基因，篩選重組子XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……；

4）、多個82bp的DNA片段組裝成大片段基因

用步驟3的XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……質粒作為供體質粒，再用切好的受體載體質粒puc-Kana做金門克隆反應，這樣就合成了與目標基因序列一致的合成基因。

3.根據權利要求1所述的一種基于質粒庫的無引物基因合成方法，其特征在于當目的基因較大時可以再進行第二輪或多輪金門克隆反應以達到合成較大的基因序列的目的基因。