[發明專利]一種基于質粒庫的無引物基因合成方法

有效

• 申請號: 201410079262.1
• 申請日: 2014-03-06
• 公開（公告）號: CN103952396A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 馬立新;陳晚蘋
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發明涉及一種基因合成方法，是一種基于質粒庫的無引物基因合成方法，屬于基因工程技術領域。?

背景技術

近年來合成生物學的研究進展非?？欤貏e是基因合成技術。全基因合成是依照某一蛋白質的基因序列，設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過重疊延伸PCR法拼接出全長，基因合成無需模板，是獲取基因的手段之一。通過全基因合成實現基因的分子改造和人工組建正成為一種實驗室常規手段。因此，建立一種能夠在相對低廉和短時間內準確和高效地設計和合成長片段基因的方法十分重要。?

隨著合成生物學的研究越來越流行，特別是基因合成方法技術的研究。到目前為止，基因合成的方法都必須依賴于化學合成的寡核苷酸引物，據研究報道全基因合成的方法主要有以下三種：一是DNA的化學合成方法，即利用DNA合成儀器直接合成單鏈的DNA片段，化學法在保證合成質量的前提下，合成的DNA片段長度一股不超過90bp，所以化學合成方法主要用于合成寡核苷酸。二是PCR介導的合成方法，如重疊延伸PCR、TBIO法、PTDS法。PCR介導的方法由于需要PCR，這樣就會導致對引物引進的錯誤進行積累和放大化，所以相對來說堿基的錯誤率比較高，據目前報道的PCR介導的合成方法錯誤率比較高，尤其對于合成大于2kb以上的DNA由于錯誤率高，所以為了得到正確的克隆，需要做多次克隆和測序的重復工作，這樣成本會很高，周期也會加長；而且PCR介導的需要DNA高溫聚合酶，dNTP等試劑，成本相對較高。三是非PCR介導的DNA合成方法，即直接通過體外或者體內的酶切酶連等操作將化學合成的DNA片段組裝起來，如DNA的固相合成技術。非PCR介導的合成方法，目前報道的主要是一種DNA的固相合成技術，如Sloning技術，這種技術雖然錯誤率是很低，但是由于在合成的時候引物需要經過特殊的修飾，引物合成的成本比較高，而且權衡成本的考慮，每次只能增加3個堿基，這樣合成大基因周期會比較長，所以不太實用。?

基因合成技術將會在越來越多的領域得到應用，并且發揮巨大的作用，但是合成基因中堿基的高錯誤率與昂貴的成本限制了全基因合成方法的應用，有必要導找新的基因合成方法來解決現有技術存在的問題，使基因合成技術得到更廣泛的應用。?

發明內容

本發明提出了一種無引物的基因合成方法平臺技術，這種基因合成方法打破了一直以來依賴于引物的基因合成技術。該方法主要通過構建一個包含有16384(4⁷，7bp的四個堿基的任意組合序列)個質粒的庫，再用該庫合成一系列相關的基因，主要是利用抗性基因重構的遺傳篩選機制，從已構建好的含有7個bp的質粒出發，通過酶切酶連操作依次進行重構，通過四種抗性基因的重構，得到若干82bp的質粒，然后再把這些82bp組裝合成長片段基因。主要步驟包括：載體的改造；16384(4⁷)個質粒的庫的構建；82bp?DNA片段的合成；多個82bp左右的DNA片段的組裝合成長片段基因。?

具體做法如下：?

1)、構建抗性基因重構載體pNew(構建過程見圖1)。?

a)、構建線性載體骨架pNew?

以商品化的pet23a、pet28b、pDEST32和利用PCR、套疊PCR、無酶克隆等常規技術構建的載體RNALIC質粒，用常規方法構建pNew的載體，以ori-PF／ori-PR(序列見表1)、pet23a質粒為模板，通過PCR擴增得到線性載體骨架，在反向引物ori-PR中引進限制性內切酶BseRI的識別位點，命名為pNew(1.9kb)(序列列表對應為NO1)。?

b)、構建線性載體骨架5SGCK?