[發明專利]抗細菌和抗瘧原蟲抗菌肽及其制備方法

無效

• 申請號: 201410077564.5
• 申請日: 2014-03-04
• 公開（公告）號: CN103788191A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 張超;顧亞萍;何新龍;曹俊;高琪
• 申請（專利權）人: 江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 殷紅梅;劉海

技術領域

本發明涉及一種抗菌肽及其制備方法，尤其是一種抗細菌和抗瘧原蟲抗菌肽及其制備方法。

背景技術

抗菌肽Scorpine是從非洲帝王蝎毒液中提取的包含有75個氨基酸和3個二硫鍵的一種蛋白多肽，在結構上類似于防御素（defensins）和抗菌肽（cecropins）。研究表明它不但能顯著阻礙瘧原蟲的生長，而且還能有效抑制枯草芽孢桿菌和肺炎克雷伯菌等病原菌的增殖。迄今其來源仍然是來自天然蝎毒液純化，但是由于蝎毒液來源及從天然物質純化產量低和工藝繁瑣，阻礙了其應用和研究。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種抗細菌和抗瘧原蟲抗菌肽及其制備方法，解決抗菌肽來源困難，生產純化難的問題。

按照本發明提供的技術方案，一種抗細菌和抗瘧原蟲抗菌肽，特征是：所述抗菌肽的編碼基因如SEQ?ID?No：1所示；所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No：2所示。

所述抗細菌和抗瘧原蟲抗菌肽的制備方法，特征是，包括以下步驟：

（1）聚合酶鏈式反應（PCR）擴增抗菌肽基因：從非洲帝王蝎毒液中提取總RNA，反轉錄獲得總cDNA；以總cDNA為模板，用上游引物和下游引物擴增得到抗菌肽基因scorpine；所述上游引物為5’-CTGCGGATCCGGCTGGATTAACGAGGAGAAG-3’，下游引物為5’-ATTACTCGAGTTAGTAGGAGAGAGGGGTGCC-3’；

（2）構建pSUMO/?scorpine表達載體：

a、純化步驟（1）得到的抗菌肽基因scorpine；

b、將pSUMO?質粒酶切、提純得到線性化的pSUMO?質粒載體；

c、將線性化的pSUMO?質粒載體和抗菌肽基因Scorpine連接，得到pSUMO/?scorpine表達載體；

（3）重組抗菌肽Scorpine蛋白表達和純化：將pSUMO/?scorpine表達載體轉化宿主菌，培養得到重組細菌，誘導、純化得到含有His-Sumo?標簽的重組抗菌肽Scorpine蛋白；

（4）重組?Scorpine?蛋白酶切：將步驟（3）純化獲得的含有?His-Sumo?標簽的重組抗菌肽Scorpine進行酶切，獲得無標簽的重組抗菌肽Scorpine。

所述步驟（3）中，所述宿主菌為BL-21（DH3）pLys感受態細菌。

所述步驟（3）中，重組細菌誘導的條件為：異丙基硫代-β-D-半乳糖苷濃度為0.5mM，誘導溫度為28℃，誘導時間為6h。

本發明以已經報道的Scorpine基因為模版設計引物利用PCR擴增技術克隆出Scorpine基因，然后成功構建攜帶Scorpine基因的表達質粒，經過誘導成功表達出重組Scorpine蛋白，經過純化，成功獲得具有抗細菌和抗瘧原蟲的功能重組Scorpine蛋白。本發明解決了抗菌肽Scorpine來源困難，生產純化難的問題，為將來大量生產及實際應用鋪平了道路。

附圖說明

圖1為構建的?pSUMO/?scorpine?表達載體示意圖。

圖2重組抗菌肽?Scorpine?蛋白表達和純化的?SDS-PAGE電泳分析圖。

圖3為重組抗菌肽?Scorpine?蛋白免疫印跡方法分析圖。

圖4為重組?Scorpine?蛋白酶切后Tricine-SDS-PAGE分析圖。

圖5為獲得的?Scorpine?蛋白抑制金黃色葡萄球菌（S.?aureus?ATCC?29213）的示意圖，橫坐標為S?corpine蛋白濃度（單位為μM），縱坐標為細菌細胞數的Log?值。

圖6為獲得的Scorpine蛋白抑制鮑曼不動桿菌（A.?baumannii?ATCC?19606）的示意圖，橫坐標為S?corpine蛋白濃度（單位為μM），縱坐標為細菌細胞數的Log?值。

圖?7為獲得的?Scorpine?蛋白抑制惡性瘧原蟲感染的示意圖，橫坐標為時間（單位為小時），縱坐標為感染率（單位為%），標號1為陰性對照樣，標號2為加入PBS緩沖液的對照樣，標號3為Scorpine?蛋白濃度為5μM的樣品，標號4為Scorpine?蛋白濃度為10μM的樣品。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。

一種抗細菌和抗瘧原蟲抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：

（1）聚合酶鏈式反應（PCR）擴增抗菌肽基因：