[發明專利]一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410077176.7
• 申請日: 2014-03-05
• 公開（公告）號: CN103789333A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 孟小林;徐進平;孟明翔;王健;潘娟
• 申請（專利權）人: 湖北肽洋紅生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N1/21;C12P21/02;A61K38/16;A61K47/48;A61P31/04;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及基因生物工程技術領域，具體涉及一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30，還涉及一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30的制備方法，還涉及一種能表達口服重組融合蛋白TAT-MAP30的基因工程菌株，以及一種口服重組融合蛋白TAT-MAP30的在抗菌、抗病毒中應用。

背景技術

MAP30蛋白

MAP30蛋白（mordtca?anti-HIV?protein?of?30）共由286個氨基酸組成。其基因組由858個堿基構成，其中，包含一個獨立的ORF閱讀框，無內含子。前23個氨基酸為引導肽，在成熟的發揮功能的MAP30蛋白中沒有檢測到引導肽序列。

目前，MAP30蛋白能使細菌、病毒、腫瘤細胞的核糖體失活的具體機制尚未得到清晰闡述，但是研究推測，MAP30蛋白的作用機制主要是通過改變DNA的拓撲結構而使核糖體失活，比如對超螺旋DNA的切割作用，將其變為缺口環狀及線狀DNA，以阻礙蛋白質的合成。

苦瓜蛋白MAP30的生物學活性較多，主要包括以下幾方面：抗病毒作用，對艾滋病毒、流感病毒、乙腦病毒、麻疹病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒、肝炎病毒、柯薩奇病毒等均有抑制作用；抗腫瘤作用，對中樞神經系統腫瘤，黑色素瘤等均有抑制生長作用；降血糖作用，苦瓜素對于自發性高血糖小鼠，以及誘發性高血糖大鼠均能夠起到促進胰島素分泌，降低血糖濃度，推遲口服蔗糖后血糖升高時間和降低血糖最高峰值的作用；抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均有一定的抑菌效果；抗生育作用；免疫原性等。MAP30蛋白的功效很多，還有待進一步探索。

TAT的研究背景

近年來發現有一些小分子的多肽可以介導外源物質穿過細胞膜，這種小分子多肽被稱之為細胞穿膜肽（cell?penetrating?peptides,CPP）。許多CPP都是來源于某些直接與宿主細胞相互作用的病毒結構蛋白的蛋白轉導結構域（protein?transduction?domains,PTD）。現在研究最多、應用范圍最廣的細胞穿膜肽（Trans-activating?transcriptional?activator,Tat）。Tat蛋白中存在3個功能結構域，分別是：位于N-端的酸性區，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之間的DNA結合區，該區域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之間的堿性區，是主要的蛋白轉導結構域，參與Tat蛋白的細胞內化作用。Schwarze發現位于Tat蛋白中第47-57位之間的11個氨基酸YGRKKRRQRRR不僅能夠獨立穿過細胞膜，而且其穿膜效率比全長的Tat蛋白還要高。這段多肽即是TAT穿膜肽。

不管是單獨的TAT穿膜肽，或者是攜帶其他大分子物質如蛋白質、寡聚核苷酸或脂質體等，在穿膜時都可以表現出較高的穿膜活性。在攜帶外源物質穿膜時，TAT介導的穿膜似乎與其要攜帶的分子大小無關，100KD的蛋白質、40nm大小的納米顆粒、甚至200nm大小的脂質體都可以經TAT運載入細胞內。而且，以這種方式運輸到細胞內的脂質體甚至可以在進入細胞內1h后仍然可保持結構的完整性。相反的，沒有與TAT穿膜肽連接的物質在與細胞共同孵育時均不能夠進入細胞內。

TAT穿膜肽的序列中由于有6個精氨酸和2個賴氨酸殘基，因此是帶有高度正電荷的多肽。以不帶電荷的丙氨酸替代其中的任何一個堿性氨基酸殘基都會使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸殘基時穿膜活性則不會發生改變。這說明TAT穿膜肽所帶的正電荷是其穿膜功能所必需的，因此推測這些正電荷很可能是能夠與真核細胞的細胞膜發生強的靜電作用，從而介導了穿膜過程。對TAT穿膜肽的親和性分析發現，它能夠與許多細胞膜表面的陰離子通過靜電作用強烈地結合，與之結合的細胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸豐富的多肽可以穿過細胞膜，而其他氨基酸如賴氨酸、組氨酸等豐富的多肽卻不具有此功能。然而，由精氨酸組成的支鏈聚合物與直鏈聚合物具有同樣的穿膜效率。此外，研究發現TAT穿膜肽不會因為手性結構的改變而影響其穿膜活性，其手性分子與自然結構具有相同的穿膜活性。這說明這種細胞穿膜肽很可能不依賴于特定的結合位點。然而，多肽的長度是影響穿膜效率的重要因素。穿膜效率與精氨酸的個數有關，含有6個或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5個精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15個氨基酸時，穿膜效率會隨著多肽大小的增加而增強。大于15個氨基酸的多肽雖然也可具有穿膜活性，但其效率卻會明顯減小。