[發明專利]一種重組質粒pET28a-hACE2及其應用

在審

• 申請號: 201410075374.X
• 申請日: 2014-03-04
• 公開（公告）號: CN103898148A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 牛佳;陸豪杰;方月琴;賈紅圣;顧準
• 申請（專利權）人: 健雄職業技術學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N9/48;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 劉燕嬌

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及人截短的人ACE2基因表達方法，它具有抑制血管平滑肌增殖、降血壓、抗動脈粥樣硬化和保護心臟功能等作用。

背景技術

腎素-血管緊張素系統(rennin?angiotensin?system,RAS)在機體中發揮有重要的生物學作用，它可以通過對心血管、腎臟的調節而維持血壓、體液和電解質的平衡。血管緊張素II（angiotensinII,AngII）在RAS系統中發揮著重要的病理生理學作用，八肽的AngII是由血管緊張素轉化酶(angiotensin?converting?enzyme,ACE)將十肽的AngI水解2個羧基而產生。2000年Tipnis等發現了在RAS系統中發揮有重要生物學作用的血管緊張素轉換酶2(ACE2)，ACE2與ACE的不同在于它是一種單羧基肽酶，可以水解AngII生成Ang（1-7），Ang(1-7)具有其高度親和力的Mas受體，Ang(1-7)與ACE2和Mas受體共同構成ACE2-Ang（1-7）-Mas軸,成為RAS系統里的另一重要的生物學作用途徑，其中多項研究表明該途徑可以對抗ACE-AngII-AT1R生物學軸所介導的多種心血管病理生理作用，如降血壓、抗動脈粥樣硬化和保護心臟功能等作用。

血管平滑肌細胞的增殖是高血壓，動脈粥樣硬化等心血管疾病發病的病理學基礎，國內外多項研究提示ACE2的過表達具有抗動脈粥樣硬化、抗炎以及抗細胞增殖等心血管保護作用。ACE2的過表達可以通過下調AT1R和ERK1/2的磷酸化水平而抑制平滑肌細胞的增殖，提示ACE2具有血管保護作用。

發明內容

發明目的：本發明的第一個目的是提供了一種重組質粒pET28a-hACE2。

本發明的的第二個目的是提供了一種重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)。

本發明的第三個目的是提供了制備重組質粒pET28a-hACE2的方法。

本發明的第四個目的是提供了重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)的制備方法。

本發明的第五個目的是提供了重組質粒pET28a-hACE2在表達人截短的rhACE2蛋白方面的應用。

本發明第六個目的是提供了重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)在表達人截短的rhACE2蛋白方面的應用。

技術方案：為實現上述目的，本發明通過下述技術方案實現：一種重組質粒pET28a-hACE2，包含載體片段pET28a和基因片段hACE2，所述載體片段pET28a來自質粒pET28a，所述基因片段hACE2來自人的Caco-2細胞。

一種重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)，包括上述的重組質粒。

制備上述的重組質粒pET28a-hACE2的方法，包括以下步驟：

1）引物設計和合成：根據ncbi報道的hACE2mRNA序列用DNAstar軟件設計針對hACE2胞外區的上下游引物；

2）總RNA的提取：收集足量的Caco-2細胞，提取總RNA；

3）采用RT-PCR擴增hACE2基因；

4）將hACE2基因與pET28a質粒片段連接得到重組質粒pET28a-hACE2。

上述的重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)的制備方法，包括所述的步驟1）～4），另外還包括步驟5），將步驟4）中連接得到的pET28a-hACE2克隆到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)。

上述的重組質粒pET28a-hACE2在表達人截短的rhACE2蛋白方面的應用。

上述的重組菌株pET28a-hACE2/BL21(DE3)在表達人截短的rhACE2蛋白方面的應用。

有益效果：與現有技術相比，本發明的優點如下：本發明利用原核表達系統E.coli克隆和表達截短的rhACE2，為ACE2的生物活性研究和生產提供基礎，且目前ACE2主要以動物平滑肌細胞為載體進行表達，原核表達系統E.coli克隆和表達比以往細胞表達的生產條件要求有所降低，生產效率和產量有明顯提高。

附圖說明