[發明專利]基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法

有效

• 申請號: 201410074665.7
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103926397A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 劉繼紅;王紅旗;張軍鋒;張玲;周玲;王建;王靜;尹海燕;祁玉峰
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/31
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于分子生物學以及熒光檢測技術領域，具體而言，涉及利用反應體系熒光偏振值的變化對赭曲霉毒素A進行檢測的方法，特點在于基于核酸適配體的鏈置換反應和基于核酸外切酶I的信號放大機制的應用，以及該方法檢測速度快、靈敏度高及操作性強。

背景技術

赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）在自然界中廣泛存在，主要由曲霉和靑霉等產生，常見的易受OTA污染的農產品主要包括小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等糧食，以及花生、蔬菜（豆類）等農作物。毒理學研究表明，OTA具有肝腎毒性以及很強的致畸、致癌和致突變作用等多種毒性，對動物和人體健康具有很大的潛在危害。鑒于此，世界各國紛紛制定出糧食及飼料中OTA的限量標準，如歐盟規定谷物原料OTA最大限量5μg/kg，谷物加工制品最大限量3μg/kg；我國規定谷類、豆類中OTA最大限量5μg/kg，以保護人民健康和調控進出口糧食。

目前檢測OTA的主要方法是薄層色譜法（TLC）、放射免疫法（RIA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、膠體金免疫層析分析法（GICA）、高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FD）、高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）、毛細管電泳技術（CE）等。基于HPLC的分析方法是目前主要的實驗室檢測方法，靈敏度高，但所需儀器昂貴、前處理復雜、檢測成本高，不適合大量樣品的快速篩查。TLC法簡單，檢測成本低，但是靈敏度較差、重現性不好且無法實現自動化；ELISA法靈敏度高、特異性好，但其操作過程比較復雜繁瑣。

近年來，有關熒光偏振免疫分析技術（FPIA）的報道逐年增加，應用范圍涵蓋臨床檢驗、毒品分析、農藥殘留分析、環境和食品檢測等方面，作為一種均相檢測方法與其它非均相方法相比具有顯著的優點：測定在溶液中進行，避免了反復多次的洗滌步驟，且易于實現自動化和提高分析方法的精度；僅需數分鐘甚至數秒鐘孵育后即可測定熒光偏振光強度，檢測速度快，有利于大批量樣品的分析測試；不受內濾作用的影響，對于有顏色和渾濁的溶液仍能很好地完成檢測任務；不需要使用放射性同位素，避免了污物不易處理的難題等。FPIA的主要局限性在于：針對不同的抗原靶標，首先要制備或得到相應的單克隆或多克隆抗體，制備周期相當長，且成本較高；由于抗體本身具有不穩定性，不易保存，易失活，容易導致檢測結果穩定性差；抗體作為一種經過體內篩選得來的蛋白類分子識別元件，很難避免交叉反應，易出現假陰性、假陽性結果；常規FPIA的檢出限一般在納摩爾以上，靈敏度有待進一步提高。以上這些不利因素都影響了熒光偏振免疫分析方法的發展。所以，有待進一步完善或尋求相關替代分析技術。

核酸適配體（Aptamer），是通過模擬自然進化過程的體外人工篩選技術——指數富集配體系統進化技術，篩選得到的具有識別功能的新型核酸分子，其本質是由一段單鏈寡核苷酸（20～60堿基），通過折疊能夠形成特有的三維結構，從而與靶分子高親和力、高特異性結合。核酸適配體的識別特性與抗體相似，但與抗體相比具有很多獨特的優勢：可在體外篩選（不依賴生物體），靶分子范圍廣（從金屬離子、毒素等小分子到酶、蛋白等生物大分子，甚至病毒、細菌和細胞等生物體），分子量小（無免疫原性），容易進行化學合成、改造與標記，生物化學穩定性好，能可逆地進行變性與復性，還能利用酶進行擴增、剪切等后續信號放大處理。各種基于核酸適配體的分析、檢測方法與技術已呈現出快速、靈敏、方便、低成本等優點，在生物醫學應用中已經顯示出廣闊的應用前景，但在真菌毒素檢測方面的應用卻相對較少，主要是由于已經篩選出來的各種真菌毒素核酸適配體較少的緣故。所以，本發明利用核酸適配體代替抗體，將其作為分子識別元件的獨特優勢與熒光偏振均相分析技術的優勢相結合，同時引入核酸外切酶Ｉ循環酶切的信號放大機制，開發了基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法，能夠很好地解決目前依賴抗體的OTA快速檢測所面臨的難題。

發明內容

為了解決目前OTA檢測方法的靈敏度不高，操作繁雜，成本過高的缺點，本發明提供了一種基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案：

本發明一方面涉及一種基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：