[發明專利]基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法

有效

• 申請號: 201410074665.7
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103926397A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 劉繼紅;王紅旗;張軍鋒;張玲;周玲;王建;王靜;尹海燕;祁玉峰
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/31
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）赭曲霉毒素A核酸適配體與單鏈熒光標記寡核苷酸探針雜交形成核酸適配體雙鏈復合物，所述的赭曲霉毒素A核酸適配體序列為5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’；單鏈熒光標記寡核苷酸探針（FAM-probe）序列為5’-FAM-CAGAGCCTAC-3’；

（2）鏈置換反應和酶切反應的循環：赭曲霉毒素A與核酸適配體雙鏈復合物發生特異性鏈置換反應，產生單鏈熒光標記寡核苷酸探針以及赭曲霉毒素A核酸適配體復合物，從而引發核酸外切酶Ｉ對單鏈熒光標記寡核苷酸探針以及赭曲霉毒素A核酸適配體復合物的酶切反應釋放出赭曲霉毒素A；釋放出的赭曲霉毒素A能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環一定次數；

（3）檢測反應體系以及空白對照的熒光偏振強度：空白對照的熒光偏振強度值為P₀，反應體系的熒光偏振強度值為P，根據熒光偏振強度值的變化值ΔP=P₀—P的標準曲線確定待檢測體系中赭曲霉毒素A的濃度。

2.根據權利要求1所述的基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法，所述的步驟（1）的步驟為將赭曲霉毒素A核酸適配體與單鏈熒光標記寡核苷酸探針進行預處理：95℃變性5min，25℃冷卻30min。

3.根據權利要求1所述的基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法，所述的步驟（2）的步驟為取50μL10mMTris-HCl反應緩沖溶液（pH8.5)，其中包含50nM的核酸適配體雙鏈復合物，0.8U/μL的核酸外切酶Ｉ以及待檢測的赭曲霉毒素A，室溫反應15min，以使赭曲霉毒素A與核酸適配體雙鏈復合物發生特異性鏈置換反應，產生單鏈熒光標記寡核苷酸探針以及赭曲霉毒素A核酸適配體復合物；釋放出的赭曲霉毒素A能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環一定次數。

4.根據權利要求1所述的基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法，所述的步驟（3）的步驟為將反應后的溶液用10mMTris-HCl反應緩沖液（pH8.5)調整反應體積為100μL，放入熒光光譜儀，以490nm為激發波長、525nm為發射波長，測定其熒光偏振強度并記錄熒光偏振強度值的變化。

5.根據權利要求1-4任意一項所述的基于核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭曲霉毒素A熒光偏振快速檢測方法，所述的待測樣品為小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等糧食以及花生、豆類蔬菜等農作物中的赭曲霉毒素A。