[發明專利]一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法

有效

• 申請號: 201410074317.X
• 申請日: 2014-03-03
• 公開（公告）號: CN103884810A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 傅金民;胡龍興;婁燕宏
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢植物園
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

1.一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法，其特征包括以下步驟：?

①內源細胞分裂素的提取：通過加提取液浸提，然后離心，過濾，脫色，最后進行真空濃縮，完成內源細胞分裂素的提?。?

②固相萃取洗脫：溶解內源細胞分裂素并獲得溶解液，過96孔的固相萃取小柱逐步洗脫，獲得內源細胞分裂素洗脫液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物；?

③高效液相色譜-質譜分析：將固相萃取洗脫物用流動相溶解，將流動相溶解液過濾后上高效液相色譜-質譜進樣分析。?

2.按權利要求1所述的一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法，其特征在于步驟①內源細胞分裂素的提?。?

A、浸提：取0.5g鮮樣，用液氮研磨，然后加提取液5ml，-20℃提取過夜，得浸提液；?

所述的提取液即甲醇：甲酸：水=15：1：4，按v/v，再加40mg/ml2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚作為抗氧化劑；?

B、離心：將浸提液在15000轉/min，4℃下離心10min，收集上清液置于新管并保存于-20℃，殘渣再用5ml提取液于-20℃提取1h，離心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得離心液；?

C、過濾：將收集的離心液過20μm濾膜以去除殘渣和較小的顆粒物，收集濾液，得過濾液；?

D、脫色：先用1ml100%甲醇和1ml1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后將過濾液過置于真空抽濾裝置上的96孔C18固相萃取小柱，并連接上真空泵，以1ml/min的速度抽濾，以去除色素和脂類物質；過小柱后，收集濾液，再用1ml的樣品提取液洗脫小柱中的樣品并收集濾液，得脫色濾液；?

E、真空濃縮：?

將收集的脫色濾液置于真空濃縮儀中，于40℃濃縮至完全干燥，即完成內?源細胞分裂素的提取。?

3.按權利要求1所述的一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法，其特征在于步驟②固相萃取洗脫：?

A、用2ml1mol/L甲酸溶解沉淀，以獲得甲酸溶解液；?

B、用1ml100%甲醇和1ml1mol/L甲酸平衡96孔的混合型陽離子交換反相固相萃取小柱，然后將甲酸溶解液過小柱以吸附激素，棄濾液；?

C、用1ml的1mol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，棄濾液；?

D、用2ml0.35mol/L的氨水沖洗小柱，棄濾液；?

E、用2ml60%甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集濾液，該收集液中含有細胞分裂素（Z，ZR，DHZ，DHZR，iP，iPA）；?

F、將洗脫液置于真空濃縮儀中40℃濃縮至完全干燥；?

G、過程B至E需將96孔的混合型陽離子交換反相固相萃取柱置于真空抽濾裝置上并連接真空泵，以1ml/min的速率進行抽濾，以提高洗脫效率。?

4.按權利要求1所述的一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法，其特征在于步驟③高效液相色譜-質譜連用分析：?

A、將真空濃縮獲得的沉淀用200～500μl流動相溶解，得流動相溶解液；?

B、用一次性醫用注射器吸取流動相溶解液過0.22μm濾膜后裝至進樣瓶中，上效液相色譜-質譜進樣分析；?

C、如樣品量過少，樣品裝入帶內撐管的進樣瓶中進行上機分析；?

D、色譜柱為安捷倫Zorbax?SB-C18液相色譜柱，柱溫為30℃，流速為200μl/min，紫外檢測波長為265nm，進樣量為10μl；?

細胞分裂素Z，ZR，DHZ，DHZR，iP，iPA的流動相：?

時間min 流動A0.1%甲酸水 流動相B100%甲醇 0 80% 20% 5 80% 20% 10 55% 45% 20 55% 45% 35 5% 95% 50 5% 95%

50.1 80% 20% 55 80% 20% 時間min 流動A0.1%甲酸水 流動相B100%甲醇 0 80% 20% 5 80% 20% 10 55% 45% 20 55% 45% 35 5% 95% 50 5% 95% 50.1 80% 20% 55 80% 20%

E、質譜條件為：離子源選擇ESI源，離子檢測模式選擇MRM，電噴霧電壓為3500V，質譜掃描范圍50～600m/z，掃描速度22000m/z/s；?

內源細胞分裂素離子及碰撞能量：?

激素 母離子 子離子 碰撞能量 離子模式 Z 220.13 119.221 41V 正離子 ZR 352.245 136.004 29V 正離子 DHZ 222.148 136.167 20V 正離子 DHZR 354.24 95.153 80V 正離子 iP 204.15 136.187 22V 正離子 iPA 336.203 204.329 17V 正離子