[發明專利]一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法

有效

• 申請號: 201410074317.X
• 申請日: 2014-03-03
• 公開（公告）號: CN103884810A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 傅金民;胡龍興;婁燕宏
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢植物園
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

技術領域

本發明涉及植物內源細胞分裂素的測定領域，具體涉及一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法。?

背景技術

草坪業基于其獨特的生態、社會、景觀、美學和經濟等功能，越來越受到重視并顯示出巨大的發展勢頭和潛力。草坪作為城市生態系統的重要組成部分，不僅具有很強的觀賞性和娛樂性，同時也在防治污染和改善生態環境中發揮了巨大的作用，鑒于此，社會對草坪草的需求不斷增大，草坪業的發展也迎來了良好的機遇。在霧霾頻發的今天，如何改善我們的居住生活環境任重而道遠，草坪草在環境改善方面的作用也顯得舉足輕重。?

植物內源細胞分裂素作為一種以促進細胞分裂為主的植物激素，普遍存在于高等植物中，可顯著調節植物的生長發育，對細胞分裂和分化具有重要作用。雖然內源細胞分裂素在植物體內的含量低，但對植物的新陳代謝、生長發育等生理過程起到重要的調節作用，包括促進細胞分裂、促進芽的分化、促進細胞擴大、促進側芽發育、消除頂端優勢、延緩葉片衰老、打破種子休眠和種子發芽等。近年來，關于內源細胞分裂素在提高植物抗逆性中的作用也受到了重視。如何精確、實時和可靠地對不同物種中微量的內源細胞分裂素進行定性定量分析，是目前植物激素研究中的熱點之一。?

細胞分裂素在大多數組織中的含量都很低，通常在10-6～10-9g之間，因此，對分析靈敏度的要求較高。七十年代初Pool首先利用高效液相色譜（HPLC）分離鑒定細胞分裂素，高效液相色譜技術滿足了植物細胞分裂素測定的靈敏度要求，且具有高選擇性、分析快速、兼具分析和制備的優點在植物內源細胞分裂素的分離和測定中得到廣泛的應用。但在樣品的提取、純化等前處理過程仍有很多?問題難以解決，樣品的前處理是一個耗時耗力的過程，特別是雜質的干擾，一直是HPLC法測定細胞分裂素的瓶頸。因此改進細胞分裂素測定過程中的前處理及純化方法，對準確測定細胞分裂素尤為關鍵。?

近年來，質譜技術的快速發展，推動了植物內源細胞分裂素的精確分析測定。質譜法具有高選擇性、高靈敏度、能提供相對分子量和結構信息的優點，國外已有學者將液相色譜與質譜相結合應用于植物激素的檢測，雖然此項技術剛剛起步，但可預見其在植物激素的檢測中將發揮重要的作用。?

液相色譜-質譜（HPLC-MS）技術具有如下優點：?

①檢測限低、靈敏度高、選擇性好，不需要衍生，化學試劑用量少；?

②實現了在植物樣品的粗提取液中直接進行生理水平植物激素的檢測。?

發明內容

本發明的目的主要是針對植物內源細胞分裂素檢測的操作復雜、耗時長、純化難度大、檢測種類少和回收率低等問題，提供一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法。本發明的特色是前處理簡單，不需要衍生，節約成本，尤其適用于草坪草內源細胞分裂素的測定，可快速、準確測定草坪草的多種內源細胞分裂素。?

本發明的目的是這樣實現的：?

一種高效分離和測定草坪草內源細胞分裂素的方法，主要包括以下步驟：?

①內源細胞分裂素的提取：?

通過加提取液浸提，然后離心，過濾，脫色，最后進行真空濃縮，完成內源細胞分裂素的提取；?

②固相萃取洗脫：?

溶解內源細胞分裂素并獲得溶解液，過96孔的固相萃取小柱（Oasis?MCX?column）逐步洗脫，獲得內源細胞分裂素洗脫液，將洗脫液真空濃縮，得固相萃取洗脫物；?

③高效液相色譜-質譜分析：?

將固相萃取洗脫物用流動相溶解，將流動相溶解液過濾后上高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）進樣分析。?

本發明具有下列優點和積極效果：?

①前處理簡單，化學試劑用量少，有效節約成本，雜質干擾小；?

②檢測靈敏度高、選擇性好，不需要衍生；?

③實現了在植物樣品的粗提取液中直接進行多種內源細胞分裂素的檢測；?

④其分離提取方法、色譜分離條件和質譜檢測方法適用于草坪草內源細胞分裂素，回收率高，達93～96%。?

附圖說明

圖1是細胞分裂素（iP、Z、DHZ、iPA、ZR、DHZR）混合標樣質譜圖；?

圖2是狗牙根葉片細胞分裂素（iP、Z、DHZ、iPA、ZR、DHZR）質譜圖。?

具體實施方式

下面結合實施例詳細說明：?

1、試驗材料：經鹽脅迫（處理濃度為200mmol/L?NaCl）處理35d（天）的狗牙根材料（選用中國科學院武漢植物園種質資源圃編號為C43的狗牙根）。?