[發明專利]一種關于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法

無效

• 申請號: 201410073154.3
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN104880551A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 吳弢;陶宏迅;周金閣
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N21/33
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 何葆芳

1.一種關于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法，其特征在于：以黃嘌呤氧化酶-NBT為反應體系，以96孔板為反應載體，以酶標儀為檢測器，檢測計算待測物在相應濃度下的黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率。

2.如權利要求1所述的高通量篩選方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

a)分別配制待測物溶液、混合底物反應液、黃嘌呤氧化酶液以及空白緩沖液；

b)在96孔板中設置對照孔、空白孔、檢測孔和校準孔，在對照孔和空白孔中分別加入200μL由溶劑與混合底物反應液按體積比1:10～1:40形成的混合液，在檢測孔和校準孔中分別加入200μL由待測物溶液與混合底物反應液按體積比1:10～1:40形成的混合液；再向對照孔和檢測孔中加入20μL黃嘌呤氧化酶液，向空白孔和校準孔中加入20μL空白緩沖液，然后將96孔板放入酶標儀內，振搖96孔板使孔內的溶液混合均勻；開始計時，在25～44℃下反應15～30分鐘；向上述每孔中加入反應終止劑使終止反應；在400～700nm的紫外光下對上述各孔進行OD值檢測；

c)計算待測物在各濃度下的黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率：

I=[(OD_對照-OD_空白)-(OD_檢測-OD_校準)]/(OD_對照-OD_空白)×100%；

其中：OD_對照為對照孔的OD值；OD_空白為空白孔的OD值；OD_檢測為檢測孔的OD值；OD_校準為校準孔的OD值。

3.如權利要求2所述的高通量篩選方法，其特征在于：所述的混合底物反應液包括黃嘌呤、氮藍四唑（NBT）和pH為6.0～9.0的PBS，其中：黃嘌呤的摩爾濃度為0.100～0.166mmol/L、氮藍四唑的摩爾濃度為0.200～0.334mmol/L、PBS的摩爾濃度為50mmol/L。

4.如權利要求2所述的高通量篩選方法，其特征在于：所述的黃嘌呤氧化酶液包括黃嘌呤氧化酶、EDTA和pH為6.0～9.0的PBS，其中：酶活力為20～120mU/mL，EDTA的摩爾濃度為0.5mmol/L，PBS的摩爾濃度為50mmol/L。

5.如權利要求2所述的高通量篩選方法，其特征在于：所述的空白緩沖液包括EDTA和pH為6.0～9.0的PBS，其中：EDTA的摩爾濃度為0.5mmol/L，PBS的摩爾濃度為50mmol/L。

6.如權利要求2所述的高通量篩選方法，其特征在于：所述的反應終止劑為摩爾濃度為0.1～0.4mol/L的鹽酸水溶液。