[發明專利]一種關于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法

無效

• 申請號: 201410073154.3
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN104880551A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 吳弢;陶宏迅;周金閣
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N21/33
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 何葆芳

技術領域

本發明涉及一種關于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法，屬于生化分析技術領域。

背景技術

黃嘌呤氧化酶是體內核酸代謝中重要的酶，廣泛分布于人體心、肺、肝等組織細胞漿內。黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化生成尿酸，并產生超氧陰離子。尿酸和超氧陰離子都是對人體有危害的物質，尿酸是痛風的一個重要生物指標，并且與心血管疾病、腎臟疾病等相關；而超氧陰離子則與癌變、衰老等相關，若不能及時清除，將會對機體造成損傷。目前廣泛使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑主要是別嘌呤醇、非布索坦，超氧陰離子清除劑則主要為BHT，BHA等化學合成類藥物，在臨床實踐中出現很多不良反應和副作用。所以，有效、低毒、價廉的黃嘌呤氧化酶抑制劑/超氧陰離子清除劑的尋找是目前研究的一大熱點。因而，建立一種方便、快捷、穩定、可靠的活性測定方法，就具有顯著的必要性。

黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選一般采用經典試管法，這種方法反應體積較大，需要的待測物量相對也較大，并且一次只能檢測一個樣本。因此，現在也發展出了其他的篩選方法，如薄層生物自顯影法，該方法能夠快速對天然產物中的活性成分進行定位與測定，但是由于IC50無法測得，限制了其運用；也曾有報道用液相色譜法進行活性物質的篩選，雖然該方法能減少復雜樣本中其它化合物的干擾，但運用此方法時，反應結束后將涉及樣品處理等繁瑣步驟，檢測環節耗時也相對較長；雖然質譜方法能通過檢測目標產物來間接測定活性，但操作的復雜及過程的耗時同樣不適宜進行大量樣本的篩選。而且，并不是所有執行活性檢測的實驗室都具備能進行液相色譜分析或質譜分析的硬件條件。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題和需求，本發明的目的是提供一種關于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法，以實現簡單操作、高靈敏度及高通量篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的目的。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種關于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法，是以黃嘌呤氧化酶-NBT為反應體系，以96孔板為反應載體，以酶標儀為檢測器，檢測計算待測物在相應濃度下的黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率。

作為一種優選方案，上述的高通量篩選方法包括如下具體步驟：

a)分別配制待測物溶液、混合底物反應液、黃嘌呤氧化酶液以及空白緩沖液；

b)在96孔板中設置對照孔、空白孔、檢測孔和校準孔，在對照孔和空白孔中分別加入200μL由溶劑與混合底物反應液按體積比1:10～1:40形成的混合液，在檢測孔和校準孔中分別加入200μL由待測物溶液與混合底物反應液按體積比1:10～1:40形成的混合液；再向對照孔和檢測孔中加入20μL黃嘌呤氧化酶液，向空白孔和校準孔中加入20μL空白緩沖液，然后將96孔板放入酶標儀內，振搖96孔板使孔內的溶液混合均勻；開始計時，在25～44℃下反應15～30分鐘；向上述每孔中加入反應終止劑使終止反應；在400～700nm的紫外光下對上述各孔進行OD值檢測；

c)計算待測物在各濃度下的黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率：

I=[(OD_對照-OD_空白)-(OD_檢測-OD_校準)]/(OD_對照-OD_空白)×100%；

其中：OD_對照為對照孔的OD值；OD_空白為空白孔的OD值；OD_檢測為檢測孔的OD值；OD_校準為校準孔的OD值。

作為進一步優選方案，所述的混合底物反應液包括黃嘌呤、氮藍四唑（NBT）和pH為6.0～9.0的PBS，其中：黃嘌呤的摩爾濃度為0.100～0.166mmol/L、氮藍四唑的摩爾濃度為0.200～0.334mmol/L、PBS的摩爾濃度為50mmol/L。

作為進一步優選方案，所述的黃嘌呤氧化酶液包括黃嘌呤氧化酶、EDTA和pH為6.0～9.0的PBS，其中：酶活力為20～120mU/mL，EDTA的摩爾濃度為0.5mmol/L，PBS的摩爾濃度為50mmol/L。

作為進一步優選方案，所述的空白緩沖液包括EDTA和pH為6.0～9.0的PBS，其中：EDTA的摩爾濃度為0.5mmol/L，PBS的摩爾濃度為50mmol/L。

作為進一步優選方案，所述的反應終止劑為摩爾濃度為0.1～0.4mol/L的鹽酸水溶液。