[發(fā)明專利]一種從貝殼類原料中提取麻痹性貝類毒素的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410072059.1
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN104876939A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發(fā)明（設計）人: 張松山;哈益明;靳靜;李慶鵬;楊寶路;李詠富;李珍;耿乙文
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院原子能利用研究所
• 主分類號: C07D487/20
• 分類號: C07D487/20
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于有機化合物提取領(lǐng)域，尤其是涉及一種從貝殼類原料中提取麻痹性貝類毒素的方法。

背景技術(shù)

麻痹性貝類毒素(paralytic?shellfish?poisoning?toxins,PSP)是一類對人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用的海洋生物毒素，主要由有毒甲藻產(chǎn)生，可通過食物鏈在貝類，如：翡翠貽貝、櫛孔扇貝、嵌條扇貝、文蛤、青蛤、近江牡蠣和織紋螺等生物體內(nèi)累積放大。當人們誤食這些染毒的海產(chǎn)品時,就會發(fā)生中毒或死亡。麻痹性貝類毒素的在全球分布越來越廣，頻率越來越高，每年發(fā)生2000起中毒事件，其中死亡率達到15%。PSP毒素是以石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)為骨架而衍生出來的一類四氫嘌呤的衍生物如式I所示，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該類毒素有50余種結(jié)構(gòu)組成成分，根據(jù)R4基團的不同可將該毒素分為氨基甲酸酯類、N-磺酰氨甲酰基類、脫氨甲酰基類和脫氧脫氨甲酰基類。

式I

目前，麻痹性貝類毒素在赤潮檢測、分子生物學、神經(jīng)生物學、醫(yī)學診斷、藥物開發(fā)、軍事戰(zhàn)劑等研究中都有應用。在食品衛(wèi)生和安全方面，隨著海洋環(huán)境的惡化，赤潮的大量發(fā)生，國內(nèi)外對貝毒的檢驗更加重視。關(guān)于麻痹性貝類毒素的提取一般采取利用海水培養(yǎng)產(chǎn)毒藻類的方法，但這在地域上有一定限制。而從貝類組織中提取富集的毒素，由于此類毒素含量很低，在提取濃縮過程中容易受到貝類基底物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)的影響，很難提取到純度比較高的樣品用于毒素相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從貝殼類原料中提取麻痹性貝類毒素的方法。

本發(fā)明提供的從貝殼類原料中提取麻痹性貝類毒素的方法，包括如下步驟：

1）將貝殼類原料與醋酸水溶液混勻至混合物的pH值為2-4后，超聲破碎，再置于沸水中加熱5-10min，冷卻后過濾，收集濾液；

2）將步驟1）所得濾液減壓濃縮后冷凍離心，取上清液用三氯甲烷萃取，取上層萃取液與乙醇混勻后于室溫攪拌20-24小時后，進行第二次離心，收集上清液減壓濃縮后干燥，再用酸化甲醇溶解后過濾，收集濾液干燥后，溶于pH值為2-4的醋酸水溶液后，上樣于凝膠柱進行柱層析，收集保留時間為160min-250min的流分，得到含有所述麻痹性貝類毒素的提取液；

所述酸化甲醇由體積比為2-5：95-98的乙酸和甲醇組成。

上述方法的步驟1）中，所述醋酸水溶液的濃度為0.05-0.2M，具體為0.1M；

混合物的pH值為2-3；

超聲破碎步驟中，功率為600-1500W，具體為600W，時間為8-30min，具體為8-10min。

步驟2）所述步驟2）冷凍離心步驟中，轉(zhuǎn)速為4000-6000rpm，具體為4000-5000rpm；離心半徑為4-6cm，具體為5cm；

時間10-12min，具體為10min；

溫度為3-7℃，具體為4℃；

所述第二次離心步驟中，轉(zhuǎn)速為8000-10000rpm；離心半徑為4-6cm，具體為5cm；時間為8-10min。

酸化甲醇可溶解毒素，并能夠去除其它剩余水溶性雜質(zhì)；

收集濾液干燥步驟中，干燥的目的是為了除去所述酸化甲醇。

所述干燥的方法可為真空冷凍干燥；

所述步驟2）柱層析步驟中，上樣量為所用凝膠柱體積的2-5%，具體為3-4%；

洗脫劑為pH值為2-4的醋酸水溶液；

洗脫速度為0.4-0.6mL/min，具體為0.5mL/min；

洗脫劑的用量為所用凝膠柱體積的3-5倍，具體為4倍；

所用凝膠柱中，凝膠的型號為Sephadex?G15或Bio-Gel-p-2；

長徑比為30-40：1，具體為30：1；

凝膠柱的長度為60-100cm；直徑為1-5cm，具體為2cm。

所述保留時間具體可為160min-200min或200min-250min；

所述貝殼類原料具體可為蝦夷扇貝或華貴櫛孔扇貝。

本發(fā)明最大限度地提高了麻痹性貝類毒素的提取率，能有效地去除組織內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)；并使毒素的生物活性損失減少到最低程度；且原料更容易獲得，提取濃縮過程中，處理溫度較低，具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為實施例1和2中Sephadex-G15凝膠柱分離熒光檢測譜圖。

具體實施方式