[發明專利]容易地分離的具有天然免疫球蛋白形式的雙特異性抗體

在審

• 申請號: 201410072042.6
• 申請日: 2010-06-25
• 公開（公告）號: CN103833855A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: S·戴維斯;E·史密斯;D·邁克多納德;K·L·奧森
• 申請（專利權）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 鄔玥;葛強

1.制備抗原結合蛋白的方法，其包括：

a.讓哺乳動物細胞表達免疫球蛋白，其包含：

包含識別第一表位的第一可變結構域的第一免疫球蛋白重鏈，其中所述第一免疫球蛋白重鏈包含第一CH3區的免疫球蛋白恒定區，該第一CH3區為選自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3區，其中所述第一CH3區與A蛋白結合；

包含識別第二表位的第二可變結構域的第二免疫球蛋白重鏈，其中所述第二免疫球蛋白重鏈包含第二CH3區的免疫球蛋白恒定區，該第二CH3區為選自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3區，其中所述第二CH3區中包含根除或減少與A蛋白的結合的修飾；

與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈配對的免疫球蛋白輕鏈；和

b.使用A蛋白將所述免疫球蛋白作為抗原結合蛋白分離。

2.權利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重鏈是人IgG重鏈。

3.權利要求2的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重鏈是人IgG1重鏈。

4.權利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白輕鏈為人免疫球蛋白輕鏈。

5.權利要求1的方法，其中所述修飾選自IMGT外顯子編號系統中的(a)95R，和(b)95R和96F，或者EU編號系統中的(a’)435R，和(b’)435R和436F。

6.權利要求5的方法，其中所述第二CH3區還包含1至5個選自下列的修飾：IMGT編號系統中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或者EU編號系統中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。

7.權利要求1的方法，其中相比于缺乏所述修飾的相應的抗原結合蛋白，所述修飾不改變或基本上不改變所述抗原結合蛋白的血清半壽期。

8.權利要求5的方法，其中所述抗原結合蛋白的第二CH3區在人中是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。

9.權利要求1的方法，其中所述細胞選自以下組：CHO細胞，COS細胞，293細胞，Hela細胞，昆蟲細胞，和視網膜細胞。

10.權利要求9的方法，其中所述細胞是CHO細胞。

11.權利要求1的方法，其中在包含A蛋白的固體支持物上分離所述抗原結合蛋白。

12.權利要求11的方法，其中所述固體支持物包括A蛋白親和柱，并且使用pH梯度來分離所述抗原結合蛋白。

13.權利要求12的方法，其中所述pH梯度為包含一個或多個位于pH3和pH5之間的pH階梯的階梯式梯度。

14.權利要求13的方法，其中所述抗原結合蛋白在大約pH3.9到大約pH4.4之間洗脫。

15.權利要求14的方法，其中所述抗原結合蛋白在大約pH4.2洗脫。

16.權利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重鏈分別由第一和第二核酸序列編碼，其中所述第一和第二核酸序列各自從基因改造的小鼠獲得。

17.權利要求16的方法，其中所述基因改造的小鼠包含一個或多個人重鏈可變區核酸序列。

18.權利要求1的方法，其中所述細胞引入

(a)編碼所述第一免疫球蛋白重鏈的第一核酸序列；

(b)編碼所述第二免疫球蛋白重鏈的第二核酸序列；

(c)編碼與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈配對的免疫球蛋白輕鏈的第三核酸序列。

19.權利要求18的方法，其中使用載體或攜帶所述核酸序列的病毒將所述第一，第二和第三核酸序列引入所述細胞。

20.權利要求19的方法，其中

(a)所述第一和第二核酸序列在同一個載體或病毒上；

(b)所述第一和第三核酸序列在同一個載體或病毒上；或

(c)所述第一，第二和第三核酸序列在同一個載體或病毒上。

21.提供相對于A蛋白異源二聚的雙特異性抗原結合蛋白的方法，其包含步驟：

提供第一免疫球蛋白重鏈，所述第一免疫球蛋白重鏈為修飾的免疫球蛋白重鏈，所述修飾的免疫球蛋白重鏈與特異性針對第一表位的抗體中的第一參考重鏈相比除了包含殘基435和436的替換之外其氨基酸序列與第一參考重鏈相同，所述修飾的免疫球蛋白重鏈表現出相對于所述參考重鏈的降低的A蛋白結合；

提供第二免疫球蛋白重鏈，其氨基酸序列與特異性針對第二表位的抗體中的第二參考重鏈相同；

提供與所述第一和第二免疫球蛋白重鏈配對的第一和第二免疫球蛋白輕鏈；

所述提供使得所述重鏈和輕鏈裝配在一起形成雙特異性抗體，其同時與所述第一表位和第二表位結合并且相對于A蛋白異源二聚。