[發(fā)明專利]動物源性制品中萊克多巴胺含量的快速測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410071091.8
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103823056A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設計）人: 周鑫櫆;洪霞;錢瀅文
• 申請（專利權）人: 甘肅省商業(yè)科技研究所
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 李琪

技術領域

?本發(fā)明屬于食品安全檢測技術領域，涉及一種測定動物源性制品中β腎上腺受體激動劑含量的方法，特別涉及一種動物源性制品中萊克多巴胺含量的快速測定方法。?

背景技術

萊克多巴胺是一種人工合成的β腎上腺受體激動劑，作為一種新型瘦肉精被一些養(yǎng)豬場使用。它可以加快畜禽生長速度，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率。人們食用了殘留萊克多巴胺的動物組織后會出現中毒癥狀，對患高血壓、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病的患者危害更大，嚴重的可能危及生命。對此藥物在養(yǎng)殖業(yè)的使用范圍和安全性世界各國的規(guī)定不盡相同。自2011年12月5日起在我國境內禁止生產、銷售和使用萊克多巴胺。

因此，國家食品安全領域強制執(zhí)行檢測動物源性制品中萊克多巴胺的含量。現有測定動物源性制品中萊克多巴胺方法有液相色譜-質譜法、氣相色譜-質譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫間接競爭法、膠體金法等。其中的酶聯免疫間接競爭法：1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者Van?Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-Linked?ImmunoSorbent?Assay，ELISA)。ELISA現在已成為目前分析化學領域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(immunoenzymatic?techniques)的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術。其中心就是讓抗體與酶復合物結合，然后根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。但用酶聯免疫間接競爭法測定動物源性制品中萊克多巴胺的含量時，存在樣品處理時間較長、靈敏度低、檢出限較高、檢測成本較高的問題。?

發(fā)明內容

?本發(fā)明的目的是提供一種樣品處理時間短、靈敏度更高、檢出限更和檢測成本低的動物源性制品中萊克多巴胺含量的測定方法，能快速測定動物源性制品中萊克多巴胺的含量。

為實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種動物源性制品中萊克多巴胺含量的快速測定方法，具體按以下步驟進行：

步驟1：精確稱取氯化鈉4.0000g、十二水合磷酸氫二鈉1.4500g、氯化鉀0.1000g和磷酸二氫鉀0.1000g，混合后用超純水溶解并定容至500mL，得到磷酸鹽緩沖液（PBS），該磷酸鹽緩沖液的pH值為7.4，磷酸鹽緩沖液過0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下；

分別精確稱取碳酸鈉0.3975g和碳酸氫鈉0.7425g，混合后用超純水溶解并定容至500mL，得到碳酸鹽緩沖液（CBS），該碳酸鹽緩沖液的pH值為9.6，碳酸鹽緩沖液過0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下；

分別精確稱取一水合檸檬酸2.5514g和十二水合磷酸氫二鈉9.1951g，混合后用超純水溶解并定容至500mL，得到底物緩沖液，該底物緩沖液的pH值為5.0，底物緩沖液過0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下；

步驟2：精確稱取牛血清白蛋白（BSA）1g，用步驟1中的磷酸鹽緩沖液定容至100mL，得到BSA封閉液，BSA封閉液過0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下；

取500mL步驟1中的磷酸鹽緩沖液，加入250μL吐溫-20，得到PBST洗液，PBST洗液過0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下；

精確稱取3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）0.0100g，溶于2mL二甲基亞砜中，得到TMB底物液，TMB底物液過0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下；

量取20.00mL小牛血清、5.00g蔗糖、1.00g牛血清白蛋白和0.01g疊氮化鈉，用步驟1中的磷酸鹽緩沖液定容至100mL，得到抗體稀釋液，并保存在4℃下；

稱取5.00g蔗糖和1.00g牛血清白蛋白，用步驟1中的磷酸鹽緩沖液定容至100mL，得到二抗稀釋液，并保存在4℃下；

步驟3：分別取質量百分比濃度為10%的雙氧水溶液21μL、步驟1配制的底物緩沖液10mL以及步驟2配制的TMB底物液200μL，混合，得到顯色液；

稱取98g濃硫酸，緩慢倒入200mL水中，此時該溶液會放熱，待溶液恢復至常溫定容至500mL，得到摩爾體積濃度2mol/L的硫酸終止液；

在盛放抗體的塑料容器中預先加滿步驟2制得的抗體稀釋液，放入37℃恒溫箱中干燥孵育90min；甩干容器內液體，得到封閉好的抗體盛放容器，干燥保存在4℃冰箱；