[發明專利]動物源性制品中萊克多巴胺含量的快速測定方法

無效

• 申請號: 201410071091.8
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103823056A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 周鑫櫆;洪霞;錢瀅文
• 申請（專利權）人: 甘肅省商業科技研究所
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 李琪

1.一種動物源性制品中萊克多巴胺含量的快速測定方法，具體按以下步驟進行：

步驟1：稱取氯化鈉4.0000g、十二水合磷酸氫二鈉1.4500g、氯化鉀0.1000g和磷酸二氫鉀0.1000g，混合，超純水溶解并定容至500mL，得磷酸鹽緩沖液；

稱取碳酸鈉0.3975g和碳酸氫鈉0.7425g，混合，超純水溶解并定容至500mL，得碳酸鹽緩沖液；

稱取一水合檸檬酸2.5514g和十二水合磷酸氫二鈉9.1951g，混合，超純水溶解并定容至500mL，得底物緩沖液；

步驟2：稱取牛血清白蛋白1g，用步驟1中的磷酸鹽緩沖液定容至100mL，得BSA封閉液；

取500mL步驟1中的磷酸鹽緩沖液，加入250μL吐溫-20，得到PBST洗液；

稱取3,3',5,5'-四甲基聯苯胺0.0100g，溶于2mL二甲基亞砜中，得到TMB底物液；

取20.00mL小牛血清、5.00g蔗糖、1.00g牛血清白蛋白和0.01g疊氮化鈉，用步驟1中的磷酸鹽緩沖液定容至100mL，得抗體稀釋液；

取5.00g蔗糖和1.00g牛血清白蛋白，用步驟1中的磷酸鹽緩沖液定容至100mL，得到二抗稀釋液；

步驟3：分別取質量百分比濃度為10%的雙氧水溶液21μL、步驟1配制的底物緩沖液10mL以及步驟2配制的TMB底物液200μL，混合，得到顯色液；

稱取98g濃硫酸，緩慢倒入200mL水中，此時該溶液會放熱，待溶液恢復至常溫定容至500mL，得到摩爾體積濃度2mol/L的硫酸終止液；

在盛放抗體的塑料容器中預先加滿步驟2制得的抗體稀釋液，放入37℃恒溫箱中干燥孵育90min；甩干容器內液體，得到封閉好的抗體盛放容器；

在盛放二抗的塑料容器中預先加滿步驟2制得的二抗稀釋液，放入37℃恒溫箱中干燥孵育90min；甩干容器內液體，得到封閉好的二抗盛放容器，干燥保存在4℃冰箱；

用步驟1制得的碳酸鹽緩沖液將抗原蛋白稀釋成質量體積濃度為5μg/mL的抗原蛋白溶液，并保存在4℃下；

在封閉好的抗體盛放容器中，用步驟2中的抗體稀釋液將抗體稀釋成質量體積濃度為3.34μg/mL的抗體溶液，并保存在4℃下；

在封閉好的二抗盛放容器中，用步驟2制得的二抗稀釋液將二抗稀釋成質量體積濃度為1μg/mL的二抗溶液，并保存在4℃下；

步驟4：將步驟3制得的抗原蛋白溶液以每孔100μL加入到酶標板內，加蓋放入4℃冰箱中干燥孵育24h，倒出孔內液體，甩干；每孔中加入PBST洗滌液300μL進行洗板，共洗板四次，拍干；然后每孔中加入1%BSA封閉液100μL，在37℃恒溫箱中干燥孵育90min后，重復洗板過程四次，拍干；

步驟5：用步驟1制得的碳酸鹽緩沖液稀釋萊克多巴胺標準品，制成九個不同質量體積濃度的萊克多巴胺溶液，該九個萊克多巴胺溶液的質量體積濃度分別為：1ng/mL、4.4ng/mL、2.2ng/mL、1.1ng/mL、0.44ng/mL、0.11ng/mL、0.044ng/mL、0.011ng/mL以及0ng/mL；該九個不同質量體積濃度的萊克多巴胺溶液作為系列標準溶液，將該九種不同濃度的萊克多巴胺溶液各自與質量體積濃度為3.34μg/mL的抗體溶液等體積混合，在37℃恒溫箱中干燥孵育10min后，以每孔100μL加入到步驟4制備好的酶標板中，在37℃恒溫箱中干燥孵育30min，反應結束后用步驟4的洗板方法，洗板三次，拍干；將質量體積濃度1μg/mL的二抗溶液以每孔100μL加入到酶標板內，在37℃恒溫箱中干燥孵育20min，反應結束后用步驟4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100μL步驟3配制的顯色液，放入37℃恒溫箱中干燥孵育10min，充分顯色；每孔加入50μL步驟3配制的硫酸終止液，輕輕振蕩混勻；酶標儀波長設定為450nm，在5min之內測定每孔的吸光值，繪制系列萊克多巴胺標準溶液的工作曲線；

同時作空白實驗，以空白作參比；

步驟6：稱取2.00g待測定的純瘦肉置于50mL離心管中，加4mL甲醇，混勻，超聲提取5～10min，5000r/min離心5分鐘，取上清液1mL，氮吹儀吹干，用步驟1配制的磷酸鹽緩沖液復原至1mL，得樣品制備液；

步驟7：將樣品制備液與抗體溶液等體積混合，在37℃恒溫箱中干燥孵育10min后，以每孔100μL加入到步驟4制備好的酶標板中，在37℃恒溫箱中干燥孵育30min，反應結束后用步驟4的洗板方法，洗板三次，拍干；將質量體積濃度1μg/mL的二抗溶液以每孔100μL加入到酶標板內，在37℃恒溫箱中干燥孵育20min，反應結束后用步驟4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100μL步驟3配制的顯色液，放入37℃恒溫箱中干燥孵育10min，充分顯色；每孔加入50μL步驟3配制的硫酸終止液，輕輕振蕩混勻；酶標儀波長設定為450nm，在5min之內測定每孔的吸光值；

步驟8：根據步驟7測得的樣品制備液的吸光度值，從步驟5繪制的系列萊克多巴胺標準溶液的工作曲線上找到該吸光度值對應的萊克多巴胺的含量，按下式計算待測動物源性制品中萊克多巴胺的含量X：

式中：X表示試樣中的萊克多巴胺含量，單位μg/kg；C₁表示步驟8測得的樣品制備液的吸光度所對應的萊克多巴胺的含量，單位ng/mL；C₀表示試樣空白液中萊克多巴胺的含量，單位ng/mL；m表示試樣質量，單位g；V₁表示步驟6中樣品制備液的總體積，單位mL；V₂表示步驟6中加入甲醇的體積，單位mL。

2.根據權利要求1所述動物源性制品中萊克多巴胺含量的快速測定方法，其特征在于，步驟1中所配制的溶液均需過0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下。