[發明專利]極體基因組重構卵子及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201410070925.3
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN104830777A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 沙紅英;朱劍虹;曹云霞;王天;紀冬梅
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/873
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

?????本發明屬于生物醫學領域，涉及極體基因組及其用途，具體涉及極體基因組重構卵子及其制備方法和用途，尤其是在制備治療母源性線粒體遺傳病制材中的用途。

背景技術

據研究報道，線粒體DNA（mitochondrial?DNA，mtDNA）是獨立于細胞核染色體外的又一基因組，被稱為人類第25號染色體，遺傳特點表現為非孟德爾遺傳方式，又稱為母系遺傳（maternal?inheritance），即母親將mtDNA傳遞給她的兒子和女兒，但只有女兒能將其mtDNA傳遞給下一代。線粒體疾病(mitochondriopathy)?是指因遺傳缺損引起線粒體代謝酶缺陷,?導致ATP?合成障礙、能量來源不足而出現的一組多系統疾病，其中，發生在卵子中的mtDNA突變引起母系家族性疾病，即母源性線粒體疾病。據不完全統計，在發生線粒體疾病致肌無力患者中，每200名婦女就有1名將線粒體肌無力遺傳下一代。另一方面，人體的重要器官(能量需求高的部位如腦、心、腎、骨骼肌和內分泌腺等)?更易受突變影響。研究顯示，絕大多數線粒體疾病影響到多器官系統的正常功能。疾病的臨床表型非常廣泛，包括線粒體腦肌病、線粒體肌病、胃腸綜合征、肌張力障礙、糖尿病、心肌病、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈病、癡呆以及耳聾等。目前，臨床針對上述種目繁多的線粒體疾病尚無有效治療方法，患者只能靠藥物短期緩解癥狀，生活質量無法保證。同時，因線粒體DNA是通過卵胞質以母源性遺傳的方式進入下一代，故通常患者被不建議生育，因此，給家庭帶來痛苦和不幸。

卵子/胚胎顯微操作技術（核移植）的發展為線粒體疾病治療帶來了希望。線粒體遺傳物質呈母源性遺傳方式，即由母親遺傳給下一代，因此可利用卵子/胚胎顯微操作技術對患線粒體疾病的母親卵子進行線粒體置換(mitochondria?replacement?MR)，使其獲得功能正常的線粒體，這種置換后的卵子所產生的后代線粒體功能將得到改善或完全恢復正常。目前，MR技術包括中期紡錘體－染色體復合物移植(Spinlde－chromosome?transfer,?ST)——將患者卵子的遺傳物質轉移到去除遺傳物質的健康卵子胞漿內、以及原核移植(pronucleus?transfer，PNT)——將患者夫婦受精卵的原核轉移到去除原核的健康受精卵胞漿內等技術手段。近年來，有研究在動物（小鼠、靈長類）實驗中，利用上述兩種MR技術手段已獲得線粒體置換后產生的后代。因此，自2011年英國人類受精與胚胎機構(HFEA,?Human?Fertilisation?and?Embryology?Authority)?即已開始著手總結近年線粒體置換調研結果，醞釀相應政策，有趨勢鼓勵進一步臨床試驗研究。該機構同時還對人-人線粒體置換重構卵的安全性開展評估，認為該技術未改變卵子主要遺傳物質—核DNA，且不同于克隆生物的目的，未發現明顯安全隱患。據稱該機構將在廣泛聽取大眾輿論意見后，出臺人線粒體置換相應政策(?Human?Fertilisation?and?Embryology?Authority?mitochondria?public?consultation?2012:?http://www.hfea.gov.uk/6896.html)。

雖然HFEA已對上述線粒體置換技術安全性進行評估并認為該技術是安全的，但線粒體DNA遺傳的瓶頸效應使上述技術尚無法真正做到徹底預防線粒體母源性遺傳疾病的發生。由于人類的每個卵細胞中大約有10萬個線粒體DNA，但其中只有隨機的一小部分（2～200個）可以進入成熟的卵細胞傳給子代，這種卵細胞形成期線粒體DNA數量劇減的過程被業內稱為“遺傳瓶頸效應”。通過“瓶頸”的線粒體DNA復制、擴增，構成子代的線粒體DNA種群類型。因此，要做到最大限度的預防線粒體疾病遺傳給子代，必須確保置換后重構的卵子中不含患者的線粒體DNA。然而，研究實踐顯示，無論中期染色體還是原核，因為能量的需要，在它們的周圍均包裹著大量的線粒體，約占胞漿中線粒體總量的40%，在核置換的過程中，這些線粒體隨核進入新的卵胞漿中，使置換后的重構卵中仍含有一定量的突變mtDNA，這些mtDNA有可能通過“遺傳瓶頸”，在子代中復制和擴增，積累到一定的閾值，仍會導致子代發病。

????本申請的發明人針對上述問題，擬提供一種極體基因組重構卵子及其制備方法和用途，尤其是在制備治療母源性線粒體遺傳病制材中的用途。該發明方法制得的重構卵子中不含患者線粒體DNA，將能主動徹底預防線粒體母源性遺傳疾病的發生。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種極體基因組重構卵子及其制備方法。