[發明專利]一種大腸桿菌分泌表達外源蛋白的質粒載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201410070632.5
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103834676A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 吳允昆;張蕾;孫麗芳;趙艷和;吳秀玲
• 申請（專利權）人: 中國科學院福建物質結構研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N15/66;G01N27/447;C12R1/19
• 代理公司: 北京慶峰財智知識產權代理事務所(普通合伙) 11417
• 代理人: 劉元霞;謝蓉

技術領域

本發明涉及用于蛋白的表達與純化技術領域，具體是涉及分泌表達外源蛋白的質粒載體及其構建方法。?

技術背景

蛋白的表達純化技術在酶與活性蛋白的低成本提取、蛋白功能研究、蛋白結構分析等多個領域有著較為重要的應用。對所純化的蛋白最基本的要求是蛋白能較好的分散于相應溶液并具備良好的生物活性。目前常規的表達載體多數基于大腸桿菌胞內表達技術，其優點是大腸桿菌易于培養和破碎，有利于蛋白的純化。不足是所表達外源蛋白局限于細胞內部，由于空間所限可溶部分的蛋白產量有限，且有很多蛋白因此在胞內形成聚集或包涵體，需要做進一步的變、復性處理。而聚集或包涵體形式的蛋白往往由于各種分子修飾作用，難以重新分散于合適的體系。在尋找復性條件時需要更多的條件摸索過程因而形成成本消耗。?

發明內容

發明人通過克隆技術引入堿性磷酸酶PhoA的信號肽序列構建了能夠分泌至大腸桿菌細胞外的外源蛋白表達載體，該載體具備Lac誘導表達系統、PhoA信號肽、多克隆位點、多聚組氨酸標簽以及T7終止子，實驗驗證了外源蛋白的誘導分泌表達能力。因此，本發明為胞外活性外源蛋白的提取提供了一種新的表達載體。?

因此，本發明提供了一種以PhoA信號肽引導蛋白分泌表達的大腸桿菌克?隆表達質粒載體，所述質粒載體含有Lac操縱子-堿性磷酸酶PhoA引導肽-TEV（煙草蝕蚊病毒蛋白酶）識別位點-多克隆位點-多聚組氨酸肽基因序列。?

在一個優選的實施方案中，所述多克隆位點是源于pET22b質粒、位于TEV酶識別序列下游的NcoI至XhoI等系列限制性內切酶識別序列。?

在一個優選的實施方案中，所述多聚組氨酸肽的長度是6個氨基酸。優選地，多聚組氨酸肽基因序列后有T7終止子序列。優選地，所述質粒載體以質粒pET22b（例如其序列為SEQ?ID?NO.3）構建。?

在一個實施方案中，所述質粒載體的序列是SEQ?ID?NO.6。?

在一個實施方案中，本發明還提供了含有本發明的表達質粒載體的宿主菌，例如大腸桿菌BL21。在一個實施方案中，所述質粒載體的序列是SEQ?ID?NO.6。?

在一個實施方案中，本發明還提供了一種構建分泌型融合蛋白的表達質粒載體的方法，所述方法通過PCR擴增技術、限制性內切酶切割和T4連接酶連接，在本發明的表達質粒載體的多克隆位點上插入待表達的外源蛋白肽段基因序列。?

在一個實施方案中，本發明提供了一種誘導分泌型外源蛋白表達的方法，其中本發明的方法構建的分泌型外源蛋白的表達質粒載體在宿主菌受到IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導后表達。在一個具體實施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相關蛋白Sip蛋白。在一個具體實施方案中，含所述表面免疫相關蛋白Sip蛋白的表達質粒載體具有SEQ?ID?NO.9的序列。?

在一個具體的實施方案中，一種檢測分泌型外源蛋白方法，其中本發明的表達質粒載體表達的外源蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測到。在一個具體實施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相關蛋白Sip蛋白。在一個具體實施方案中，含所述表面免疫相關蛋白Sip蛋白的表達質粒載體具有SEQ?ID?NO.9的序列。?

在一個具體的實施方案中，用本發明的表達質粒載體表達的外源蛋白能有效分泌至胞外，提高可溶外源蛋白的產量和得率。在一個具體實施方案中，所述?外源蛋白是表面免疫相關蛋白Sip蛋白。在一個具體實施方案中，含所述表面免疫相關蛋白Sip蛋白的表達質粒載體具有SEQ?ID?NO.9的序列。?

本發明針對目前大腸桿菌中表達的外源蛋白多為胞內蛋白，從而部分蛋白易于形成包涵體、不利于純化的問題，設計和構建了在大腸桿菌胞外表達外源蛋白的質粒載體。該載體在商業質粒pET22b的基礎上引入堿性磷酸酶PhoA的信號肽，在其下游設計多克隆位點，TEV酶識別切割序列和用于蛋白純化的多聚組氨酸肽段，實現外源蛋白基因的插入、外源蛋白的分泌表達和活性蛋白的提取。由于采用Lac誘導系統，在IPTG誘導的條件下即可啟動外源蛋白的高效表達。該質粒表達體系為外源蛋白的表達和純化提供新的材料。?

附圖說明：