[發明專利]一種利用連鎖不平衡在家系中篩查Wilsondisease基因突變的方法

有效

• 申請號: 201410070111.X
• 申請日: 2014-02-28
• 公開（公告）號: CN103820555B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發明（設計）人: 李衛東;楊付花
• 申請（專利權）人: 李衛東
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司12211
• 代理人: 楊慧玲

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體而言，本發明涉及一種利用連鎖不平衡在家系中篩查Wilson?disease基因突變的方法，尤其是用于家系篩查的檢測方法。?

背景技術

肝豆狀核變性，又稱Wilson?Disease(WD)，是一種較為常見的常染色體隱性遺傳病，其致病基因為ATP7B，在中國漢族人群的攜帶率為1/50.Wilson?Disease的發病呈漸進性，如果能早期發現純合性突變者，可以進行排銅治療，但如果發現較晚，則會造成不可逆的神經損害.ATP7B基因較大，用DNA測序方法檢測成本很高.臨床多采用血漿銅藍蛋白檢測篩檢，但其敏感性不及DNA測序，且攜帶者的檢出是銅藍蛋白檢測的最大局限.曾有利用微衛星序列多態性檢測ATP7B基因區域的單倍型來推測其突變情況，但微衛星序列的基因分型對設備的要求和成本均較高，難以用來進行人群水平的大規模篩檢。?

目前，Wilson?disease的診斷主要依賴于：臨床表現包括神經和精神癥狀、旰異常、角膜色素環；輔助檢查包括血漿銅藍蛋白水平的降低、24小時尿銅排泄量增加、肝銅含量的增加以及核磁共振等影像學檢查。但是這些臨床表現常存在缺失，比如在幼兒患者中神經和精神癥狀在患病早期并不出現，并且生化指標的準確性也會受到其他因素的影響，比如外源性的雌激素或者懷孕期都可以使血清銅藍蛋白的水平升高，這些因素也可以使Wilson?disease患者個體的?血清銅藍蛋白含量高于正常低值。現有的檢查，沒有一項能夠作為確診的指標，易出現誤診和漏診。?

發明內容

為了克服臨床表現的缺失和檢查指標的不準確，本發明提供一種單倍型檢測Wilson?disease的方法，利用連鎖不平衡在家系中快速篩查Wilson?disease基因突變，該檢測方法用于進行家系篩查，能夠及早發現雜合攜帶者，也能夠區分出無癥狀的患者和雜合攜帶者。?

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：選取與ATP7B(ATPase，Cu++transporting，beta?polypeptide)基因突變呈連鎖不平衡的6個單核苷酸多態性位點(Single?Nucleotide?Polymorphisms，SNP)包括rs1061472、rs2147363、rs1924611、rs7993492、rs1801243、rs28942074，以SNP基因分型的方法，不經過測序，僅依靠6個多態性位點確定Wilson?disease患者個體兄弟姐妹(或三級以內的親屬)的基因突變狀態。達到對先證者的家系的快速篩查，找出雜合攜帶者同時也區分出無癥狀者的目的。?

本發明的有益效果是，不經過測序，依靠6個多態性位點確定先證者家系中雜合攜帶者的同時，也能夠區分出無癥狀者。可一次檢測多個樣本，成本低、快速。?

具體實施方式

在有患者的家系中，同時檢測先證者以及兄弟姐妹(或三級以內親屬)的?基因突變狀態。針對6個SNP位點設計Taqman探針，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(ploymerase?chain?reaction)鑒定每個位點的基因型狀態。用以上6個SNP位點構建單倍型。比較先證者親屬與先證者的單倍型，Wilson?Disease是常染色體隱性遺傳病，若與先證者單倍型完全相同的為病人(純合子)，完全不同的為正常個體，一半相同的為攜帶者(雜合子)。?

注：表格是6個SNP位點在染色體上的位置以及基因頻率。?

本發明不需要經過DNA測序，依靠6個SNP位點來確定先證者以及家系成員的基因突變狀態，可以同時檢測數百例樣本，所以用于家系的篩查簡便快速。由于6個SNP位點存在連鎖不平衡，物理距離小于0.1Mb，發生重組的可能性小于0.1％，具有較好的特異性。?

另外根據6個位點的基因頻率可以計算出每個位點均為純合的概率大約為0.002，這樣6個位點檢出的敏感度為99.8％?

所以本發明的優點：?

1.簡便快速，適合大樣本篩檢，成本較低；?

2.敏感度和特異性均較好；?

3.由于基因型在受精卵時期基因即已經確定，可用于新生兒的篩檢，而銅藍?蛋白的降低有一個逐漸發展的過程，且對突變攜帶者的檢出不敏感，本發明有利于早期發現和早期排銅治療。?

上述實施方式旨在舉例說明本發明可為本領域專業技術人員實現或使用，對上述實施方式進行修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，故本發明包括但不限于上述實施方式，任何符合本權利要求書或說明書描述，符合與本文所公開的原理和新穎性、創造性特點的方法、工藝、產品，均落入本發明的保護范圍之內。?