[發(fā)明專利]合成唾液酸化寡糖及類似物的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410068732.4
• 申請(qǐng)日: 2014-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN103820513A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李學(xué)兵;呂迅;陶勇;林白雪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12P19/26
• 分類號(hào): C12P19/26;C07H15/10;C07H15/203
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及合成唾液酸化寡糖及類似物的方法。

背景技術(shù)

唾液酸(sialic?acid,Sia)，是天然存在的、含有九個(gè)碳原子且?guī)ж?fù)電荷的、吡喃結(jié)構(gòu)的一類單糖，是包含有50多個(gè)成員的一個(gè)集合名詞。Neu5Ac及其眾多衍生物是唾液酸家族的主要成員，占已知43種的99%。寡糖（oligosaccharides）又稱低聚糖，為兩個(gè)或兩個(gè)以上（一般指2-10個(gè)）單糖單位以糖苷鍵相連形成的糖分子，廣泛分布于自然界。唾液酸化寡糖即分子中含有一個(gè)或者若干個(gè)唾液酸分子的一類寡糖化合物。唾液酸寡糖化合物具有重要的生物信息傳遞等功能，現(xiàn)代生物技術(shù)和分析測試技術(shù)的快速發(fā)展使得唾液酸的生物學(xué)功能得到進(jìn)一步明確，在細(xì)胞分裂，信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞識(shí)別，癌癥，免疫，炎癥，微生物感染等眾多生命過程和疾病形成過程中，唾液酸寡糖都扮演著非常重要的角色。隨著唾液酸生物學(xué)和藥物學(xué)研究的快速發(fā)展，對(duì)唾液酸寡糖的樣品種類和量的需求正在大幅增加，如何快速大量地獲得高純度的唾液酸寡糖及其衍生物已成為該領(lǐng)域中最重要的基礎(chǔ)問題之一。

目前獲得唾液酸寡糖的方法主要有：從天然原料中提取、化學(xué)合成和酶法合成。一般來講，通過提取方法得到的多是唾液酸寡糖的混合物，如果要得到單一的唾液酸寡糖，還必須對(duì)該混合物進(jìn)行純化，通常目標(biāo)化合物在天然產(chǎn)物中的含量很低，因此非常不經(jīng)濟(jì)。化學(xué)合成的靈活度相對(duì)較大，但是糖類化合物上有多個(gè)可以反應(yīng)的羥基，這使得化學(xué)法合成必須依賴繁瑣的選擇保護(hù)作用及糖基化后的去保護(hù)作用才可以達(dá)到特異性選擇合成的目的，大大限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。生物催化由于其步驟簡單、反應(yīng)條件溫和、立體選擇性和區(qū)域選擇性較高，因此得到了人們的重視和廣泛研究。

目前合成唾液酸寡糖的主要途徑是酶促合成方法，該方法以唾液酸及類似物為起始原料，在CMP-唾液酸合成酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的共同作用下，合成唾液酸寡糖及類似物。雖然該方法產(chǎn)率高，但該方法的起始原料——唾液酸類分子價(jià)格昂貴，其中最常見的N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac），其市場價(jià)也高達(dá)2527元/克（百靈威），還有采用CMP-唾液酸作為起始原料，價(jià)格更加昂貴；因此極大制約了唾液酸寡糖的合成規(guī)模。

綜上所述，由于唾液酸寡糖及其衍生物的重要生物學(xué)意義和藥物研究價(jià)值，其高效制備技術(shù)的建立已成為糖科學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問題。因此，發(fā)展一套完整的唾液酸寡糖及其衍生物的高效合成方法，可填補(bǔ)國內(nèi)外該技術(shù)領(lǐng)域的空白，為唾液酸寡糖的生物學(xué)和藥學(xué)研究提供物質(zhì)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種合成唾液酸寡糖或其類似物的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1）將供體化合物、MgCl₂和丙酮酸鹽與工程菌E.coliΔnanTEK/pNA菌懸液混勻，反應(yīng)，收集上清液；

2）向所述上清液中加入受體化合物、胞苷三磷酸、CMP-唾液酸合成酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶，混勻，反應(yīng)，收集反應(yīng)產(chǎn)物，即為唾液酸寡糖或其類似物；

所述供體化合物為N-乙酰神經(jīng)氨酸或其類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式Ⅰ所示：

所述受體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式Ⅱ或式Ⅲ所示：

所述唾液酸寡糖或其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式Ⅳ或式Ⅴ所示：

其中R₁、R₂、R₃均選自O(shè)H、F、N₃、OAC、NH₂、SO₃H中任一種；

X1、X2均為NHAc或OH；

Y為或

上述方法中，

所述供體化合物為如下式Ⅵ-Ⅸ所示的化合物：

所述受體化合物為如下式X-XIV所示的化合物：

所述唾液酸寡糖或其類似物為如下式XV-XXIII所示的化合物：

所述E.coliΔnanTEK/pNA菌懸液為工程菌E.coliΔnanTEK/pNA菌懸浮在100mM、pH=7.5的Tris?HCl緩沖液中得到的溶液，且E.coliΔnanTEK/pNA在懸浮液中的OD₆₀₀為4.5-5.5；

所述E.coliΔnanTEK/pNA在懸浮液中的OD₆₀₀具體為5。

上述方法中，