[發(fā)明專利]一種利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410068690.4
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103865921A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱新平;李偉;趙建;洪孝友
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

1.一種利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是含以下步驟：

（1）選取三線閉殼龜?shù)闹杭?，預(yù)處理后，用MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA；

（2）設(shè)計(jì)能覆蓋三線閉殼龜線粒體全基因組的16對引物，以步驟（1）中提取獲得的三線閉殼龜DNA為模板，利用16對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和拼接后，首次擴(kuò)增獲得三線閉殼龜線粒體全長。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是：步驟（1）中所述的預(yù)處理包括采用無水乙醇浸泡三線閉殼龜?shù)闹杭滓约坝?×PBS緩沖液浸泡步驟。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是：步驟（1）中用MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA時(shí)，MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒中TL?Buffer初始加入量為210～220μL；消化時(shí)采用搖床氣浴，溫度為56～60℃，轉(zhuǎn)速為60～70rpm/min，時(shí)間為3～5小時(shí)；洗脫液為無菌蒸餾水25～50μL，重復(fù)洗脫2次。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是：步驟（2）中所述的16對引物由以下序列所示的引物組成：SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6、SEQ?ID?No.7和SEQ?ID?No.8、SEQ?ID?No.9和SEQ?ID?No.10、SEQ?ID?No.11和SEQ?ID?No.12、SEQ?ID?No.13和SEQ?ID?No.14、SEQ?ID?No.15和SEQ?ID?No.16、SEQ?ID?No.17和SEQ?ID?No.18、SEQ?ID?No.19和SEQ?ID?No.20、SEQ?ID?No.21和SEQ?ID?No.22、SEQ?ID?No.23和SEQ?ID?No.24、SEQ?ID?No.25和SEQ?ID?No.26、SEQ?ID?No.27和SEQ?ID?No.28、SEQ?ID?No.29和SEQ?ID?No.30、SEQ?ID?No.31和SEQ?ID?No.32。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是：步驟（2）中PCR擴(kuò)增時(shí)PCR反應(yīng)體系包括濃度為2.5mM的dNTP2.4μL，三線閉殼龜模板DNA1μL，濃度為10μmol的引物各0.5μL，Taq聚合酶0.5μL，10×Buffer4μL，加水至40μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是：步驟（2）中PCR擴(kuò)增時(shí)PCR反應(yīng)條件為：95℃變性2min后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)椋?5℃變性30s，52℃～60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃繼續(xù)延伸10min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴(kuò)增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是：步驟（2）中獲得的三線閉殼龜線粒體全長為16675bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.33所示。