[發明專利]一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法

有效

• 申請號: 201410068690.4
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN103865921A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 朱新平;李偉;趙建;洪孝友
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明屬于三線閉殼龜技術領域，具體涉及一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法。

背景技術

龜鱉類是較古老且形態最為特化的一支爬行動物，在地球上出現的最早記錄是晚三疊紀，距今已有約2.2億年的歷史，被稱為“活化石”。近幾十年來，全世界由于非法捕殺和棲息地喪失而處境危險的龜鱉種類越來越多，絕大部分已被列入瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)附錄中。特別是在亞洲，作為食物、傳統藥物和寵物貿易的受害者，多數龜鱉成員在野外幾乎已絕跡，引發了國際關注的亞洲龜類危機（Asian?Turtle?Crisis）現象。2011年，國際生物保護學會(WCS)和龜生存聯盟（TCC）共同發布了一個“Turtles?in?Trouble”的專題，旨在引起全世界對龜鱉類生存現狀的重視。報道指出如果沒有強有力的保護措施，更多的淡水龜和海龜物種將在未來的十年里滅絕。

目前，關于龜鱉動物的研究主要集中在種質資源調查、形態學觀察、增養殖研究以及進化和系統學關系等方面。涉及分子遺傳、功能基因、物種鑒定和家系選育等分子生物學方面的研究比較少，遠不及哺乳動物、兩棲類、鳥類甚至魚類研究的深入。造成這種狀況的主要也是重要原因之一，就是研究樣本特別是取樣方式的限制。鑒于目前龜鱉的生存狀態，龜鱉分子生物學研究的樣本取樣方式值得人們關注。

三線閉殼龜（Cuora?trifasciata）又名金錢龜，是樣本珍貴、極度瀕危的物種，被世界自然保護聯盟（IUCN）列為極度瀕危物種并被收錄于瀕危物種貿易公約（CITES）的附錄II中。2006年以來，學術界關于三線閉殼龜（金錢龜）種的界定以及其與閉殼龜屬其它成員之間的系統進化關系都一直存在爭論。但由于非損傷性取樣提取DNA的問題一直沒有得到解決，因此對其的相關研究一直處于初級階段，甚至三線閉殼龜的線粒體全序列至今沒有報道。

目前，三線閉殼龜常用的取樣方法有三種，即傷害性取樣(destructive?sampling)、非傷害性取樣(nondestructive?sampling)和非損傷性取樣(noninvasive?sampling)。對于一些樣本珍貴、極度瀕危甚至受法律保護的物種、需要大規模取樣的研究或者長期跟蹤的群體實驗，非傷害性及非損傷性取樣提取DNA用于后續的實驗研究，則顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，該方法步驟簡潔，成本低，屬于非損傷性取樣，能獲得三線閉殼龜線粒體全序列。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，含以下步驟：

（1）選取三線閉殼龜的趾甲，預處理后，用MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA；

（2）設計能覆蓋三線閉殼龜線粒體全基因組的16對引物，以步驟（1）中提取獲得的三線閉殼龜DNA為模板，利用16對引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行測序和拼接后，首次擴增獲得三線閉殼龜線粒體全長。

在上述步驟中：

本發明步驟（1）中所述的預處理包括采用無水乙醇浸泡三線閉殼龜的趾甲以及用1×PBS緩沖液浸泡步驟。

本發明步驟（1）中用MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA時，MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒中TL?Buffer初始加入量優選為210～220μL；消化時采用搖床氣浴，溫度優選為56～60℃，轉速優選為60～70rpm/min，時間優選為3～5小時；洗脫液優選為無菌蒸餾水25～50μL，重復洗脫2次。

本發明步驟（1）中用MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA時，TL?Buffer初始加入量較好為220μL，消化時采用搖床氣浴，溫度較好為56℃，轉速較好為60rpm/min，時間較好為3～5小時，洗脫液較好為無菌蒸餾水25～50μL，重復洗脫2次。